基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的天南星抗癌機制研究

郝愛平，吳啟康，國會艷，薛巨坤，魏繼承，任如意

（牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

天南星（Arisaema consanguineum）是天南星科天南星屬植物。味苦辛，性溫，有毒；是臨床燥濕化痰、祛風(fēng)止痙、散結(jié)消腫的常用藥，外用治療癰腫及蛇蟲咬傷［1］。近年來的研究表明天南星具有良好的抗腫瘤活性。戚笑笑等［2］利用H22 肝癌細胞皮下移植動物模型來評價天南星的體內(nèi)抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)天南星的醇提取液和水提取液均具有抗癌作用。楊宗輝等［3］通過研究中藥天南星提取物誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721 細胞凋亡及其生化機制，發(fā)現(xiàn)天南星提取物有誘導(dǎo)SMMC-7721 細胞程序性死亡的作用，其生化機制可能是通過激活特定的傳導(dǎo)通路caspase 途徑實現(xiàn)的。張志林等［4］采用小鼠腋下接種腫瘤細胞法測定天南星醇提物的抗腫瘤活性，結(jié)果揭示了中藥天南星有可能通過增強機體的免疫力來實現(xiàn)其抗腫瘤活性。張巖等［5］通過研究中藥天南星提取液對人肺癌A549 細胞作用發(fā)現(xiàn)天南星醇提液和水提液對人肺癌A549 細胞均有一定的增殖抑制作用，天南星醇提液抑制作用更為明顯。研究表明天南星的化學(xué)成分有凝集素類、生物堿類、苷類、氨基酸類、甾醇類、揮發(fā)油類、脂肪酸類等。但是哪些化合物對于抗癌有作用以及天南星的抗癌機制目前尚不明確。

中藥存在“多組分，多靶點和協(xié)同作用”的特點，該特點與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“多靶點”思想極為一致，所以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被認為是研究中藥的好方法［6-8］?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對某種中藥材的研究、對中藥制劑的研究、對于中藥治療某些疾病的機制研究日益增多。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)針對生物網(wǎng)絡(luò)并分析這些網(wǎng)絡(luò)中藥物，目標和疾病之間的聯(lián)系［9，10］。有研究人員采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了莪術(shù)預(yù)防心血管和腦血管疾病的有效機制，同時預(yù)測了莪術(shù)的潛在靶點，發(fā)現(xiàn)莪術(shù)是預(yù)防心血管和腦血管疾病的主要成分，梔子、麝香和冰片作為輔助藥物來輔助主要成分的作用，這些作用可能共同起到協(xié)同作用［11］。Xiang 等［12］運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對靈桂珠甘湯（LGZGD）治療第二代抗精神病藥物（SGAs）誘導(dǎo)的代謝綜合征（MetS）時發(fā)現(xiàn)JUN 是靈桂珠甘湯的推定靶標，APOA1 是MetS 和SGAs的已知靶標之一，LGZGD 可能抑制JUN，從而增加APOA1 的表達，通過一些重要途徑維持代謝穩(wěn)態(tài)。Hua 等［13］通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補血湯的靶標與鐵離子結(jié)合，造血，活性氧產(chǎn)生，細胞凋亡，炎癥和相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)。當(dāng)歸補血湯可以促進鐵離子結(jié)合和造血活動，抑制炎癥，產(chǎn)生活性氧，阻斷細胞凋亡，對貧血癥有顯著作用。綜上所述，研究人員可以有效利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來探究中藥的各種作用機制以及各種成分之間的相互作用并篩選出中藥重要的化合物、靶點以及通路。因此本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對天南星的活性化合物、抗癌靶點以及通路進行分析，為今后進一步揭示天南星的抗癌機制和抗癌新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 天南星活性成分的獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.tcmsp.php），輸入研究材料的名稱“天南星”，點擊“ingredients（成分）”根據(jù)閱讀文獻并結(jié)合研究材料的實際情況，本次研究將設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物半衰期（Drug half-life，HL）≥4 篩選并獲得需要研究的活性成分。

1.2 天南星抗癌靶點數(shù)據(jù)的獲得

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.tcmsp.php）和閱讀文獻獲得天南星活性成分靶點。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)常用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Universal Protein）uniprot（http：//www.uniprot.org/uploadlists/）對基因名稱統(tǒng)一化后再與GeneCards 數(shù)據(jù)庫中的癌癥相關(guān)基因進行映射；最終利用UniProt數(shù)據(jù)庫將收集到的龍葵抗癌靶點-基因名稱統(tǒng)一化，并建立抗癌靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 天南星中活性成分抗癌靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用cytoscape3.7.1 來整理數(shù)據(jù)把節(jié)點繪制成便于觀看和研究的可視化網(wǎng)狀圖，以不同顏色的節(jié)點（node）表示藥效成分、潛在核心作用靶點及作用通路。邊（edge）用來連接某一藥效成分和其潛在作用靶點以及作用靶點和其注釋的相關(guān)通路。

1.4 天南星抗癌靶點互作及生物過程和通路富集分析

以STRING 平臺（https：string-db.org/）分析天南星抗癌靶蛋白的相互作用。使用ClueGO 軟件對抗癌靶點進行生物過程分析。利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（http：//david. niaid. nih. gov）和ImageGP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）對抗癌靶點進行通路富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 天南星中活性成分分析

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選和閱讀文獻共找到天南星的48 種主要活性成分，選取與抗癌作用有關(guān)的活性成分有42 種（表1）。

2.2 抗癌靶點數(shù)據(jù)分析

通過閱讀文獻和使用uniprot 數(shù)據(jù)庫一共獲得了373 個靶點，通過篩選發(fā)現(xiàn)其中有291 個靶點與抗癌作用有關(guān)，除去相同的靶點，共獲得65 個抗癌靶點（表2）。

2.3 天南星活性成分-抗癌靶點網(wǎng)絡(luò)圖分析

通過Cytoscape3.7.1 作圖（圖1）將抗癌靶點與化合物建立網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，以高度值（degree）≥10 為標準進行篩選，高度值越大的化合物或基因說明越重要。篩選出重要的化合物有松油醇（C5，Degree=14）、亞油酸（C7，Degree=11）、（8E，11E，14E）-8，11，14-二十二碳三烯酸甲酯（C18，Degree=12）、茚（C21，Degree=15）、2-甲基-5-丙基呋喃（C22，Degree=15）、表油菜素甾醇（C24，Degree=11）、1-乙?；?B-咔啉（C29，Degree=14）、正戊基苯（C30，Degree=34）、2-甲基 苯并 呋喃（C35，Degree=21）。 重 要的靶 點有

ADH1B（Degree=10）、ADH1C（Degree=14）、LYZ（Degree=14）、PTGS2（Degree=19）、NCOA2（Degree=19）、CHRM1（Degree=10）、GABRA2（Degree=12）、CHRM2（Degree=10）、GABRA1（Degree=13）。以上研究表明天南星可能通過作用于這些基因發(fā)揮抗癌作用。

表1 天南星中潛在有效成分信息

表2 與抗癌有關(guān)的65 個靶點

圖1 天南星活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 抗癌靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析

通過天南星抗癌靶點的靶蛋白互作圖（圖2）分析可以看出，有64 個蛋白有互作，PDE3A 與其他靶蛋白沒有相互作用關(guān)系。圖中共有64 個節(jié)點，255條邊，平均度為7.97?？梢愿鶕?jù)評分的多少，來篩選出哪些靶點之間的聯(lián)系更多、相互作用更強。以Sore≥0.990 的 有 PRF1、GZMB、RXRA、NCOA1、NCOA1、ESR1、RXRA、NCOA2、WNT3A、CTNNB1、NCOA2、ESR1、CTNNB1、CCND1、NCOA1、ESR2、ABCG8、ABCG5、ESR1、CCND1。 其 中 PRF1 和GZMB 之間的得分是0.999，RXRA 和NCOA1 之間、NCOA1 和ESR1 之間、RXRA 和NCOA2 之間的得分都是0.997，WNT3A 和CTNNB1 之間、NCOA2 和ESR1 之間、CTNNB1 和CCND1 之間的得分都是0.995，NCOA1 和ESR2 之間的得分是0.994，ABCG8和ABCG5 之間的得分是0，992，ESR1 和CCND1 之間的得分是0.990，因此以上這些靶點的抗癌作用相對強一些。

圖2 抗癌靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析

2.5 抗癌靶點生物過程及通路富集分析

天南星抗癌靶點共調(diào)控12 個不同的生物學(xué)過程（圖3），包括活性氧合成過程、腺體形態(tài)發(fā)生、調(diào)節(jié)肌肉收縮、積極調(diào)節(jié)急性炎癥反應(yīng)、細胞內(nèi)類固醇激素受體信號通路、調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖、調(diào)節(jié)平滑肌細胞收縮、乙醇脫氫酶活性、鋅依賴性、對滲透壓的反應(yīng)、消化系統(tǒng)過程、化學(xué)突觸傳遞和百葉酸生物合成過程。類固醇受體共激活因子3（SRC-3）基因在人肝癌組織的表達水平顯著高于癌旁組織，SRC-3 基因高表達與肝癌的臨床病理特征密切相關(guān)，SRC-3 可能成為潛在的肝癌分子標志物或治療靶點［14］。通過DAVID 數(shù)據(jù)庫的分析表明，天南星的抗癌靶點共有79 條通路。其中P＜0.05 的通路共有62 條。這些通路有一些與結(jié)直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、甲狀腺癌、前列腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌有關(guān)。有些與細胞凋亡、癌癥中的蛋白多糖、癌癥的途徑、化學(xué)致癌作用、P53 信號通路、P13K-Akt 信號通路有關(guān)，這些通路間接起到抗癌作用。 通路分析氣泡圖（圖4）橫軸代表P，縱軸代表所選取的30 條重要通路。Rich factor 越大，表示富集的程度越大［15］。分析表明研究的關(guān)鍵靶蛋白主要富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、癌癥通路、癌癥中蛋白多糖通路、甲狀腺激素信號通路、P53 信號通路等。

圖3 靶點GO 功能分析

3 小結(jié)與討論

圖4 通路氣泡圖

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的多靶點研究思想，對新藥的研發(fā)有更深遠的意義。本文通過建立天南星-抗癌靶點網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)松油醇、亞油酸、（8E，11E，14E）-8，11，14-二十二碳三烯酸甲酯、茚、2-甲基-5-丙基呋喃、表油菜素甾醇、1-乙?；?β-咔啉、正戊基苯、2-甲基苯并呋喃等物質(zhì)的高度值高于其他化合物。重要的靶點有ADH1B、ADH1C、LYZ、PTGS2、NCOA2、CHRM1、GABRA2、CHRM2、GABRA1 等。有研究發(fā)現(xiàn)ADH1B 的基因多態(tài)性與食管癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)［16］。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）基因，已證實在許多病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，它是腫瘤、癌癥形成的促進劑，且與多種繁殖性能，如排卵、胚胎移植、蛻膜、分娩等相關(guān)［17］。如PTGS2 負責(zé)炎癥和有絲分裂發(fā)生中涉及的前列腺素類生物合成，與抗前列腺癌有關(guān)。PTGS2 多態(tài)性與中國東北地區(qū)肺癌的潛在原因有潛在的協(xié)同關(guān)聯(lián)［18］。PTGS2的多態(tài)基因編碼環(huán)氧合酶-2（COX-2），環(huán)氧合酶-2（COX-2）過度表達與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)［19］。NCOA2 是核受體輔激活因子2，NCOA2 不但可以促進人胃癌細胞增殖及生存能力，還可通過抑制凋亡、促進其轉(zhuǎn)移和侵襲作用增強細胞存活能力［20］。GABRA1 在結(jié)腸癌細胞系中的異位過表達導(dǎo)致了對癌細胞生長的強烈抑制，GABRA1 和LAMA2 可能在大腸癌發(fā)生中起作用，并可能成為臨床上篩選和檢測大腸癌的潛在生物標志物［21］。因此，天南星可能通過作用于以上抗癌靶點起到抗癌作用。通過DAVID 數(shù)據(jù)庫的分析表明，天南星的抗癌靶點共有79條通路。其中癌癥通路、TNF 信號通路、結(jié)直腸癌通路、小細胞肺癌通路、非小細胞肺癌通路、甲狀腺癌通路、前列腺癌通路、胰腺癌通路、子宮內(nèi)膜癌通路、細胞凋亡通路等與癌癥直接相關(guān)。神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、癌癥中蛋白多糖通路、P53信號通路、P13K-Akt 信號通路、AMPK-ACC 信號通路、Ca2+信號通路等與癌癥間接相關(guān)，這些通路間接起到抗癌作用。研究表明，腫瘤壞死因子α（TNFα）是一種多能性細胞因子，其與受體TNFR1 或TNFR2 結(jié)合后向下傳導(dǎo)的信號能夠決定細胞的生死存亡［22］。P53 可通過參與調(diào)控惡性腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲等機制在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。P53 信號通路的抗癌作用還基于P53 是腫瘤抑制蛋白，能夠減輕正常細胞因生理逆境所帶來的的危害［23］。酪氨酸的代謝水平與乳腺癌有密切的關(guān)系，酪氨酸代謝水平低會增加患乳腺癌的風(fēng)險［24］。PI3K-Akt 信號通路參與腫瘤細胞存活、增殖、侵襲與遷移的調(diào)控［25，26］。AMPK-ACC 信號通路的激活在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）發(fā)生和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮了促進作用［27］。Ca2+信號通路通過介導(dǎo)DADS 誘導(dǎo)了人鼻咽癌CNE2 細胞凋亡［28］。蛋白多糖與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，與腫瘤血管的生成有關(guān)［29］。綜上所述，推測天南星主要通過ADH1B、ADH1C、PTGS2、NCOA2 等抗癌靶點參與上述通路起到抗癌作用，這為今后天南星抗癌機制的深入研究提供了理論依據(jù)。