女性類風濕關(guān)節(jié)炎DNA甲基化特征

彭勇，黃嫻倩，張可悅，應穎，褚贊波，吳玉寒，潘迎紫，陳勇

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性的以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，可導致關(guān)節(jié)的進行性破壞，最終導致殘疾，全球人群的患病率大約 1%[1]。迄今為止，對于RA的病因及發(fā)病機制尚未完全明確，且目前尚無根治方法。臨床上治療的主要目標是控制癥狀和延緩疾病進展，而現(xiàn)有的治療方法對部分患者無效[2]。

RA是由環(huán)境因素和遺傳因素等多種因素導致的一種復雜疾病，其中遺傳因素起主要作用，但傳統(tǒng)的遺傳學并不能完美的解釋RA的發(fā)病過程。表觀遺傳是指不涉及DNA序列改變的情況下，基因功能發(fā)生可逆、可遺傳的改變。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的，也是被研究最多的基因表觀修飾方式之一。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyItransferases, DNMTs)的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基基團，將CpG島二核苷酸的胞嘧啶(C)甲基化為5-甲基化胞嘧啶(5-mC)的過程。DNA 甲基化在維持基因組及染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、基因激活及沉默中具有重要作用。近年來，DNA甲基化在RA的發(fā)病、診斷和治療中的作用已逐步被發(fā)現(xiàn)[3]。疾病與候選基因甲基化狀態(tài)的關(guān)聯(lián)研究受研究者主觀因素、基因數(shù)量、統(tǒng)計效應等影響，容易遺漏真正的疾病關(guān)聯(lián)基因。本研究通過高通量DNA甲基化基因芯片檢測技術(shù)(illumina human methylation EPIC BeadChip 850 K)對早期RA患者和健康人群全血的全基因組DNA進行差異甲基化位點分析，篩選出2組差異甲基化位點，根據(jù)差異甲基化位點尋找相關(guān)差異基因；通過分析相關(guān)基因參與的生物學過程、分子功能、細胞組成及信號通路，進一步探索DNA異常甲基化與RA發(fā)病機制之間的關(guān)系，為DNA甲基化在RA的診斷及治療方面提供線索和依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象

隨機選取2018年6月至2019年8月就診于中國科學院大學寧波華美醫(yī)院門診的12例女性類風濕關(guān)節(jié)炎患者為RA組。RA組納入標準：(1)診斷符合2010年 ACR/EULAR 制定的類風濕關(guān)節(jié)炎分類標準[4]；(2)初治(1個月內(nèi)未接受過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物質(zhì)制的治療)，病程≤6月；(3)疾病處于活動期，RA疾病活動評分：DAS 28評分>3.2。選取年齡及性別配對的體檢中心體檢的12名健康者作為對照組，無類風濕關(guān)節(jié)炎家族史。排除標準：兩組均排除其他風濕性疾病、癌癥、精神病等疾病，且均無血緣關(guān)系。本研究已通過中國科學院大學寧波華美醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及濃度測定:獲取RA組和對照組晨起、空腹8 h以上的外周靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，采用QIAamp DNA試劑盒(德國QIAGEN公司)提取全基因組DNA；運用Thermo Nanodrop 2000分光光度儀測定DNA濃度及純度。檢測DNA濃度并記錄(OD260/OD280 比值應在 1.8～2.0)，-80 ℃保存。

1.2.2 DNA修飾:應用Zymo EZ DNA Methylation Kit試劑盒(美國Zymo公司)對DNA進行亞硫酸鹽修飾，使DNA甲基化。

1.2.3 DNA擴增、斷裂、雜交:本部分由上海歐意生物醫(yī)學科技有限公司提供技術(shù)支持，完成實驗并分析。采用PCR技術(shù)擴增后將DNA片段化，片段化的DNA沉淀回溶，采用Illumina Human Methylation EPIC BeadChip 850 K 甲基化基因芯片(美國Infinium公司)進行雜交。應用芯片掃描軟件iscan對芯片灰度掃描，掃描結(jié)果使用GenomestudioV2011.1(美國 Illumina 公司)進行分析。

1.2.4 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控:為確保實驗結(jié)果的可靠性，實驗中對甲基化芯片雜交過程進行了嚴格的質(zhì)控分析。對每樣品提供12 332個probe作為質(zhì)控項目，主要包括兩部分：(1)sample-independent control:Staining Control、Hybridization Control、Target Removal Contro、Extension Control；(2)sample dependent control: Bisulfite conversion control、Stringency Control、Non-sepecific Binding Control、Non-ploymorphic Control等，結(jié)果符合Infinium正常實驗的結(jié)果，芯片狀態(tài)正常。

1.3 差異甲基化基因的篩選方法和標準

用于比較的2組DNA都設(shè)置3次重復及以上則采用T-Test Model，比較每個基因甲基化位點在RA組與正常對照組間的差異(P<0.05)，可獲得甲基化水平發(fā)生改變的基因位點；再將得到的P值轉(zhuǎn)化為Diff score值[Diff score=10×sgn(βref-βcond) ×log10(P)；對照組的Diff score為0]，Diff Score取正值代表RA組相對對照組甲基化程度升高，負值相反。設(shè)定RA組樣本Diffscore值<-13或>13；且Delta_Beta>0.17或<-0.17，即為顯著差異甲基化基因；其中Delta_Beta值的計算，即為對照組與RA組Avg_Beta相差的結(jié)果，即RA組與對照組在每個位點的甲基化差異程度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

芯片經(jīng)iSCAN灰度掃描后，應用GenomestudioV2011.1軟件行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換與數(shù)據(jù)歸一化，可以得到芯片上每個甲基化點非甲基化探針和甲基化探針強度的原始信號值。經(jīng)過美國Illumina公司提供的方法進一步標準化，得到甲基化點的水平值(Avg-Beta)，DetectionPvalue等。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，應用t檢驗比較每個基因甲基化位點在RA組與正常對照組間的差異。采用R2.15.0統(tǒng)計軟件，對差異CpG點進行聚類分析；對差異甲基化點所在的基因作Gene Ontology分析；并采用京都基因和基因百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫進行Pathway分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本信息

2組研究對象的基本臨床信息，包括性別、年齡、民族、血沉、C反應蛋白、病程、DAS-28評分等見表 1。健康對照組的性別、年齡及民族與RA組基本匹配，且差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 差異甲基化點分析

RA組與對照組相比，共有24 183個CpG位點甲基化水平發(fā)生改變(P<0.05)，其中有13 672個高甲基化位點，10 511個低甲基化位點，RA組全基因組的高甲基化位點約占差異性位點的56.5%。進一步根據(jù)差異甲基化基因篩選標準，RA組顯著差異甲基化位點共191個，其中上調(diào)的差異表達基因有106個,下調(diào)的差異表達基因有85個(圖 1)。191個甲基化位點共對應著115個基因，根據(jù)Beta-Difference值大小展示了高甲基化(表2)和低甲基化(表3)程度差異最明顯的一些基因位點的信息。通過篩選發(fā)現(xiàn)其中15個差異化基因可能與RA相關(guān)，其中高甲基化基因如IL-26、PCSK6、MICB、NCF4、GALNT9、PHF19、ACTN1等，低甲基化基因如CYP2E1、SMAD3、SLC1A1、CD44、AGPAT1、KCNQ1、AHRR等。對191個差異甲基化位點進行聚類分析(圖2)，RA 組和對照組被清晰正確地聚類，說明篩選出的差異甲基化位點有良好的鑒別力。在191個顯著差異的甲基化位點中，RA組較對照組存在更多的高甲基化位點，而對照組存在較多低甲基化位點。

表1 RA組與對照組人群的基本信息表Table 1 Basic information of RA group and control group

2.3 Gene Ontology分析

對差異甲基化位點對應的115個基因進行注釋分析，通過運用Database for Annotation, Visualiza-tion and Integrated Discovery 6.8(DAVID數(shù)據(jù)庫)對差異甲基化區(qū)域的分子功能生物學過程進行富集度分析(Gene Ontology enrichment analysis, GO分析)，包括生物學過程、細胞組成以及分子功能，結(jié)果按P值排序排列(padj<0.05)。差異甲基化基因參與生物學過程富集于：細胞因子介導的信號通路、炎癥反應、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路、免疫反應調(diào)節(jié)、T細胞活化、透明質(zhì)酸的代謝等方面(圖3)。

圖 1 RA組中差異甲基化基因火山圖Fig 1 Volcano map of differentially methylated genes in RA group

表2 Beta-diff Top 20 高甲基化基因位點Table 2 Beta diff top 20 hypermethylation gene loci

表3 Beta-diff Top 16 低甲基化基因位點Table 3 Beta diff top 16 hypomethylation gene loci

圖 2 RA組和對照組191個差異甲基化位點聚類圖

2.4 Pathway分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異甲基化位點對應的基因進行Pathway分析，RA組特異的差異甲基化基因與沙門菌感染、Toll樣受體信號通路、炎性腸病、NF-κB信號通路、TRP通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)、趨化因子信號通路、TNF信號通路、破骨細胞分化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等信號通路有關(guān)，共計18個通路具有統(tǒng)計學意義(padj<0.05)(圖 4)。

圖 4 RA組與對照組差異甲基化基因Pathway分析結(jié)果Fig 4 Pathway analysis results of different methylation genes between RA group and control group

3 討論

DNA甲基化幾乎只存在于人類DNA的CpG島，在人類基因組中大約有30 000個CpG島；而約60%～70%的基因啟動子與CpG島相關(guān)，這表明CpG島甲基化是基因表達調(diào)控的重要組成部分[5]。因此，異常的DNA甲基化可在不改變DNA核苷酸序列的情況下使基因失活及轉(zhuǎn)錄抑制。DNA甲基化具有遺傳穩(wěn)定的特性，在經(jīng)歷多次細胞分裂后仍可被穩(wěn)定地遺傳；此外，DNA甲基化也是唯一一種在DNA提取和純化后仍存在的表觀遺傳修飾[6]；與基因突變相反，DNA甲基化這一表觀遺傳修飾同時是可逆的。因為這些特征，DNA甲基化是目前被研究的最多的一種表觀遺傳修飾方式。目前與DNA甲基化相關(guān)的疾病包括各種腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟疾病及免疫系統(tǒng)疾病[7]。

國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血單個核細胞(PBMCs)和RA成纖維樣滑膜細胞(RA-FLS)的DNA存在廣泛的低甲基化[8]，而最新的國外研究則發(fā)現(xiàn)，早期RA患者的T-淋巴細胞和B-淋巴細胞中DNA存在廣泛的高甲基化[9]。另一些研究表明，RA患者外周血單個核細胞中IL-6基因的啟動子甲基化水平明顯低于健康對照組，IL-6表達激活將促進關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生[10]；在RA-FLS中也發(fā)現(xiàn)趨化因子配體基因CXCL12的啟動子區(qū)域存在低甲基化，這將導致RA患者MMPs表達增加以及關(guān)節(jié)破壞[11]；此外，與骨關(guān)節(jié)炎患者相比，RA患者FCRLA、CCDC88C、BCL11B、APOL6四個基因存在低甲基化和表達下調(diào)，而表達下調(diào)的CCDC88C基因可通過Wnt信號通路促進RA疾病的進展[12]。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)部分候選基因(c-Myc、mTOR、HIF-1α)的低甲基化可能增加RA的發(fā)病風險[13]，以上研究均表明DNA甲基化可能參與了RA的發(fā)病。

本研究發(fā)現(xiàn)，RA組與對照組相比DNA甲基化水平存在明顯差異，其中RA組全基因組的高甲基化位點約占差異性位點的56.5%。同時發(fā)現(xiàn)了15個與RA相關(guān)的差異基因，其中高甲基化基因如IL-26、PCSK6、MICB、NCF4、GALNT9、PHF19、ADAMTS4、ACTN1等，低甲基化基因如CYP2E1、SMAD3、SLC1A1、CD44、AGPAT1、KCNQ1、AHRR等。在高甲基化基因中，有文獻報道中國漢族類風濕關(guān)節(jié)炎患者CD4+T細胞中GALNT9基因高甲基化改變[14]，這與本研究結(jié)果一致。MICB及NCF4的基因多態(tài)性參與了RA的發(fā)病[15-16]。IL-26基因表達的IL-26屬于IL-10家族，RA患者血清中IL-26的濃度高于健康人，RA滑液中IL-26的濃度顯著高于RA血清；IL-26可誘導RA患者單核細胞產(chǎn)生促炎細胞因子IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF-α)，同時上調(diào)多種趨化因子的表達，還可促進Th17細胞的分化[17]。體外細胞實驗證實，IL-26可通過增加RA-FLS中NF-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達和直接刺激破骨細胞分化，促進RA破骨細胞的形成[18]。在RA-FLS中前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素6 (proprotein convertase subtili-sin/kextin type 6, PCSK6)表達明顯增減，PCSK6可通過NF-κB等信號通路，促進RA-FLS的增殖、遷移、侵襲和炎癥反應[19]；而沉默PCSK6基因可能在RA的發(fā)生發(fā)展中起保護作用[20]。PHF19、ADAMTS4及ACTN1基因表達產(chǎn)物均參與或促進了RA的發(fā)生發(fā)展[21]。在低甲基化基因中，Mok等[22]發(fā)現(xiàn)RA患者T淋巴細胞CYP2E1基因的啟動子區(qū)域存在顯著的低甲基化，且與RA疾病活動和骨侵蝕相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。CD44基因表達的CD44蛋白是一種多形性跨膜蛋白，已有研究證實RA患者關(guān)節(jié)滑膜中存在大量CD44亞型及其配體透明質(zhì)酸，兩者結(jié)合可促進RA的滑膜炎癥及關(guān)節(jié)軟骨的破壞[23]。KCNQ1和SMAD3的基因多態(tài)性則是RA的遺傳危險因素[24-25]。此外，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)1/Smads信號通路參與了RA-FLS的遷移和侵襲，促進了關(guān)節(jié)損傷和病理改變[26]。目前已知吸煙會增加患RA的風險，而吸煙的RA患者AGPAT1基因啟動子區(qū)存在顯著的低甲基化，該基因表達與RA炎癥密切相關(guān)[27]。吸煙還可增加RA患者滑膜組織中芳香烴受體抑制因子(AHRR)基因的表達[28]。目前對于RA基因甲基化的研究還處于早期，本研究通過檢測分析發(fā)現(xiàn)15個差異甲基化的基因可能與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這將有助于揭示DNA甲基化在RA發(fā)病機制中的作用，上述差異甲基化位點對應的基因也有望成為RA發(fā)病、疾病進展和疾病嚴重程度的生物標記物或預測因子。

RA以女性多發(fā)，男女患病比例約為1∶3。因此，本研究以女性患者為研究對象，以期了解女性類風濕關(guān)節(jié)炎患者DNA甲基化的特征。有研究發(fā)現(xiàn)，女性RA患者CD4+T細胞中X性染色體上的CD40L啟動子區(qū)發(fā)生了低甲基化，并且發(fā)現(xiàn)CD40L mRNA表達上調(diào)，而在男性RA患者的CD4+T細胞沒有發(fā)現(xiàn)這種改變[29]；這可以部分解釋RA在女性中高發(fā)的原因。本研究對象均為女性，發(fā)現(xiàn)RA組中存在115個甲基化顯著差異的基因，其中X性染色體上存在一個低甲基化基因FRMPD4，深入研究該基因甲基化改變在RA發(fā)病中的作用，可能有助于揭示女性更易患RA的遺傳背景。

通過GO分析發(fā)現(xiàn)差異甲基化的基因參與生物學過程富集于：細胞因子介導的信號通路、炎癥反應、NF-κB信號通路、免疫反應調(diào)節(jié)、T細胞活化、透明質(zhì)酸的代謝等方面；通過Pathway分析發(fā)現(xiàn)差異甲基化的基因與Toll樣受體信號通路、炎性腸病、NF-κB信號通路、TRP通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)、趨化因子信號通路、TNF信號通路、破骨細胞分化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等信號通路有關(guān)。RA是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主的自身免疫病。免疫細胞如巨噬細胞、T和B淋巴細胞向炎癥關(guān)節(jié)遷移、聚集并活化，同時多種炎癥通路如Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路等，促使多種促炎細胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等高表達，促使關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生[30]。因此，認為上述差異甲基化基因可促使各種炎癥因子產(chǎn)生，誘導免疫細胞的活化，通過多種信號通路導致RA骨質(zhì)侵蝕及關(guān)節(jié)破壞，從而參與RA的發(fā)病和促進疾病進展。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)是DNA甲基化的關(guān)鍵酶。有研究證實DNMTs的抑制劑如阿扎胞苷(5′-AZA)可下調(diào)RA小鼠FLS的多種炎癥因子的表達，從而抑制RA的進展[31]。Svenden等[27]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的抗風濕藥物(如甲氨蝶呤)可以誘導RA炎癥相關(guān)基因AGPAT1啟動子的低甲基化區(qū)域逆轉(zhuǎn)為高甲基化?？傊珼NA的異常甲基化參與了RA的發(fā)病過程，而抑制DNA異常甲基化可能可以抑制RA發(fā)生及發(fā)展。因此，筆者推測這些差異基因可能成為RA治療的潛在靶點。

本研究不足之處：首先選取的樣本量較少，且僅選了女性作為研究對象，設(shè)計存在一定的局限性；其次，僅對差異化甲基基因進行了分析，未對相關(guān)基因表達水平進行測定及驗證；在今后的研究中，筆者將擴大樣本量進行研究，同時對這些基因所表達的mRNA和蛋白質(zhì)進行分析，對相關(guān)基因進行深入驗證，從而為探討DNA甲基化在RA發(fā)生發(fā)展中及治療中的作用提供依據(jù)。