超高效液相色譜法測定秋葵籽油中苯并芘的含量

李單單

摘 要：為建立超高效液相色譜法檢測秋葵籽油中苯并芘的含量，故采用分析方法——樣品以正己烷溶劑提取，過固相萃取柱，通過超高效液相色譜法檢測樣品含量。結(jié)果顯示，在該色譜條件下苯并芘的標(biāo)曲線性r>0.9999，在洗脫液中加入1mL乙腈氮吹，回收率85.6%～94.5%，苯并芘的檢出限為0.2μg/kg，定量限為0.5μg/kg。因此得出結(jié)論，該方法操作簡單、效率高、回收率高、結(jié)果可靠，適用于秋葵籽油中苯并芘的含量檢驗。

關(guān)鍵詞：苯并芘? 秋葵籽油? 超高效液相色譜? 固相萃取柱

秋葵籽油是從成熟的優(yōu)質(zhì)黃秋葵籽中提取出來的純天然高級食用油，因其富含維他命、蛋白質(zhì)、卵磷脂及鈣、磷、鐵、鉀、鎂等礦物質(zhì)，所以是一種營養(yǎng)豐富的高檔植物油。作為一種新型植物油，秋葵籽油不僅可以用于烹飪、糕點、罐頭食品等，還可以加工成人造奶油、烘烤油、調(diào)味油（有特殊香味）等以供食用。有報道稱，經(jīng)常食用秋葵籽油可以促進(jìn)人體血液循環(huán)，防止動脈硬化及動脈硬化并發(fā)癥、高血壓、心臟病、心力衰竭、腎衰竭、腦出血，以及抗衰老、改善人腦記憶力，預(yù)防老年癡呆癥、改善消化系統(tǒng)功能等。此外，人體對秋葵籽油中不飽和脂肪酸的消化吸收率較高，其不僅有助于減少胃酸、阻止發(fā)生胃炎及十二指腸潰瘍等，還具有潤腸功能，長期食用可以有效緩解便秘。在醫(yī)藥領(lǐng)域，秋葵籽油可作為燒傷藥、胃潰瘍藥、傷口愈合藥、止痙攣藥、神經(jīng)鎮(zhèn)定劑等。正是因為秋葵籽油的營養(yǎng)價值和保健功能，所以引起了醫(yī)療、食品、農(nóng)業(yè)等許多領(lǐng)域科學(xué)家的關(guān)注。采用氣相色譜法對秋葵籽的主要脂肪酸成分進(jìn)行分析，得出其主要脂肪酸含量分別為：豆蔻酸0.2%、棕櫚酸30.6%、棕櫚油酸0.5%、硬脂酸4.2%、油酸23.8%、亞油酸30.8%、亞麻酸0.3%、花生酸0.6%，且香味香度約為芝麻油的4倍。但是秋葵籽油在生產(chǎn)加工及使用過程中經(jīng)常處于高溫條件下，故可能引起有害物質(zhì)苯并芘的產(chǎn)生。

苯并芘（Benzopyrene）是一種含苯環(huán)的稠環(huán)芳烴，其于環(huán)境中廣泛存在[1]，且在大氣中的含量已被列入環(huán)境監(jiān)測的常規(guī)項目[2]。最初，苯并芘由煤焦油中分離得到;從煤煙、焦油、瀝青、香煙煙霧中都可以檢測出來，并且具有強(qiáng)烈的致癌作用——可以誘發(fā)肺癌等。根據(jù)苯環(huán)的稠合位置不同，可將苯并芘分為兩種——苯并[a]芘（1，2-苯并芘）和苯并[e]芘（4，5-苯并芘），后者是前者的同分異構(gòu)體，存在于煤煙和焦油中。人們?nèi)粘Ｉ钪薪佑|到的大多是苯并[a]芘，英文縮寫為B[a]P，CAS號為50-32-8，化學(xué)式為C20H12，分子量為252.31。苯并[a]芘在常溫條件下的狀態(tài)是黃色粉末，熔點為179℃，難溶于水，微溶于甲醇、乙醇，易溶于苯、甲苯、二甲苯、丙酮、乙醚、氯仿、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑。苯并芘在工業(yè)上無生產(chǎn)和使用價值，一般只作為生產(chǎn)過程中形成的副產(chǎn)物隨廢氣排放。1933年，英國科學(xué)家J.W.Cook等人從瀝青中分離得到苯并芘純品，然后合成證明其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行動物實驗，最終誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了皮膚癌。由此，苯并芘被確認(rèn)為化學(xué)環(huán)境致癌物[3]。目前，針對苯并芘測定的相關(guān)文獻(xiàn)中多采用酶聯(lián)免疫吸附測定法[4]、膠體金法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、液相色譜-熒光檢測法等[8-16]。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

安捷倫1290型超高效液相色譜儀（配熒光檢測器G1321B），美國安捷倫科技有限公司;EclipsePlus-C18色譜柱（2.1×50mm，1.8μm）;BaP-2固相萃取柱、Silica固相萃取柱，月旭科技;固相萃取儀，美國安捷倫科技有限公司;ML204T電子分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司;氮氣發(fā)生器LCMS30-1-E，英國Parker;氮吹儀N-EVAP 24，美國Organomation;多位渦旋振蕩器，廣東晉元;超聲波清洗器，中國昆山舒美;0.22μm有機(jī)濾膜，天津津騰公司。

苯并芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，Dr.Ehrenstorfer;分析純二氯甲烷、分析純正己烷，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;色譜純乙腈，上海安譜實驗科技股份有限公司;實驗用水為Milli-Q Advantage A10超純水，美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

使用十萬分之一的天平稱取1mg苯并芘標(biāo)品，用色譜純乙腈定容至100mL，配制成濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液;吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液用色譜純乙腈定容至100mL，配制成濃度為100ng/mL的中間標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后用色譜純乙腈稀釋成5個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，濃度分別為0.5、1、5、10、20ng/mL;采用超高效液相色譜儀對該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上機(jī)檢測，并建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2 液相色譜條件

液相色譜柱：EclipsePlus-C18色譜柱（2.1×50mm，1.8μm）;色譜柱柱溫：35℃;流動相：乙腈︰水=88︰12;流速：0.3mL/min;進(jìn)樣量：5μL;熒光檢測器：激發(fā)波長275nm，發(fā)射波長415nm

1.2.3 樣品前處理

提取步驟：準(zhǔn)確稱樣（0.400g）→加入正己烷（5mL）→振蕩混勻（20min）→超聲提?。?0min）→待凈化。

SPE凈化步驟：將Silica硅膠柱串聯(lián)在BaP-2固相萃取柱上→活化（5mL二氯甲烷、5mL正己烷）→上樣（將凈化液加入到串聯(lián)柱上，并用2mL正己烷潤洗盛放樣品的離心管，確保完全上樣）→淋洗1（5mL正己烷淋洗整個串聯(lián)柱，然后棄去Silica硅膠柱）→淋洗2（5mL正己烷淋洗BaP-2固相萃取柱）→洗脫（5mL二氯甲烷，收集洗脫液）→定容（洗脫液中加入1mL乙腈，40℃條件下氮吹至近干，用乙腈定容至1mL，渦旋0.5min，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，供UPLC測定）。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

在“1.2.2”條件下對“1.2.1”系列標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，結(jié)果見表1、圖1。

2.2 精密度試驗

在“1.2.1”中選擇濃度為5ng/mL的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。苯并芘峰面積的RSD為0.9%，說明儀器精確度較好，見表2。

2.3 回收率試驗

按照GB 5009.27-2016的方法，采用分子印跡柱洗脫后直接氮吹。由于二氯甲烷的揮發(fā)性太強(qiáng)而容易將目標(biāo)物帶走，故試驗在洗脫液中加入1mL乙腈以防止目標(biāo)物損失。取陰性樣品，苯并芘的3個添加水平分別為2、10、20μg/kg，加入對應(yīng)體積的標(biāo)準(zhǔn)品后靜置過夜，按照“1.2.3”的前處理方法處理樣品，然后上機(jī)測定，結(jié)果見表3。

2.4 檢出限和定量限

根據(jù)信噪比S/N=3和S/N=10確定目標(biāo)物的檢出限和定量限，苯并芘的檢出限為0.2μg/kg，定量限為0.5μg/kg。

3 討論

苯并芘是一類對人類健康危害較大的致癌物，其污染問題長期受到社會關(guān)注。秋葵籽中苯并芘產(chǎn)生的來源主要包括以下幾點：①新鮮采摘的秋葵籽晾曬在柏油路上，瀝青隨著高溫融化并與秋葵籽慢慢混合;②苯并芘廣泛存在于環(huán)境中且親脂性極強(qiáng)，并易在種植、收獲及加工等環(huán)節(jié)受到污染;③秋葵籽在高溫下反復(fù)烘烤和蒸炒，可能因燒焦而產(chǎn)生苯并芘[17-18]。

本試驗利用超高效液相色譜法檢測秋葵籽中的苯并芘含量，出峰時間早，節(jié)省檢測時間，不僅分離度滿足試驗需求，更可以節(jié)省流動相中的乙腈，故實用性較強(qiáng)。秋葵籽油是一種高檔植物油，隨著生活水平的提高，人們越來越追求飲食健康，因此，加強(qiáng)對秋葵籽中苯并芘的檢測能夠為人們放心食用秋葵籽油提供數(shù)據(jù)支持。

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