Real-time PCR法檢測水產品中異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖源性成分

信紅梅，姚 琳，陸鍵萍,3，曲 夢，江艷華，李風鈴，郭瑩瑩，王聯(lián)珠,

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.農業(yè)農村部水產品質量安全檢測與評價重點實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071；3.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266000）

鱈魚是鱈形目（Gadiformes）魚類的總稱，屬脊椎動物門（Vertebrata）、脊椎動物亞門（Vertebrata）、真骨魚綱（Teleostei），是世界上最重要的底層魚類，也是國際水產品貿易中最主要的品種之一，具有較高的營養(yǎng)價值和經濟價值[1-2]。目前，市場上常見的鱈形目魚類主要有大西洋鱈（Gadus morhua）、太平洋鱈（G. macrocephalus）、狹鱈（G. chalcogrammus）、細鱗壯鱈（Albatrossia pectoralis）、黑線鱈（Melanogrammus aeglefinus）和阿根廷無須鱈（Merluccius hubbsi）等。此外，市場上還包含一些商品名中帶“鱈”字，但在分類學上與鱈魚毫無關聯(lián)但價格很高的品種，如裸蓋魚（Anoplopoma fimbria）（銀鱈魚、黑鱈）、小鱗犬牙南極魚（Dissostichus eleginoides）和莫氏犬牙南極魚（Dissostichus mawsoni）（白鱈魚）[3-4]。學名與商品名的不統(tǒng)一，加之高值鱈魚多以魚塊、魚段和魚片的形式銷售，失去了可供鑒別的外部形態(tài)特征，導致命名混亂、以次充好、以假冒真的現(xiàn)象屢屢出現(xiàn)?！坝汪~”體型較大，肉質白皙，切塊后與高值鱈魚魚塊外形十分相似，成為假冒高值鱈魚的最主要品種。

“油魚”是異鱗蛇鯖（Lepidocybium flavobrunneum）和棘鱗蛇鯖（Ruvettus pretiosus）的俗稱，這兩種魚同屬于鱸形目的蛇鯖科（Gempylidae），分別是異鱗蛇鯖屬和棘鱗蛇鯖屬的唯一種[5]，分布于熱帶及亞熱帶海域，脂肪含量極高，其中90%為C32～C36的蠟酯[6]。該蠟酯并不被人體消化、吸收，而是蓄積在直腸內，引起腹痛、惡心、嘔吐和胃腸痙攣等癥狀，嚴重者導致油性腹瀉，雖不足以致命，但對嬰幼兒、胃腸敏感人群及孕期婦女具有較高 風險[5-6]。此外，“油魚”中含有大量的組氨酸，若運輸、保存條件不當，組氨酸會轉化成組胺，食用后嚴重者會危及生命[7]。

“以油充鱈”現(xiàn)象不僅在我國，在美國[8]、加拿大[7]、 澳大利亞[6,9]等各國均有過類似報道，不僅擾亂了市場經濟秩序，而且?guī)聿豢珊鲆暤氖称钒踩L險。日本、韓國和意大利等國已經禁止銷售和進口“油魚”[10]；美國、加拿大、澳大利亞和歐盟部分成員國等要求銷售“油魚”時必須加上適當標簽[5]；我國除香港地區(qū)出臺了《有關識別及標簽：油魚/鱈魚的指引》之外[4]，目前我國尚未對“油魚”有禁止或限制食用的規(guī)定，這與缺乏與之配套的檢測技術不無關系。針對“油魚”，即異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖，建立物種特異性檢測方法成為當務之急。

本研究針對異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖的線粒體細胞色素C氧化酶I（cytochrome C oxidase subunit I，COI）基因序列，分別設計了兩對物種特異性引物和探針，基于實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）建立了異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖源性成分的檢測方法，以期為保護消費者權益、打擊水產品摻雜使假提供可靠的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍鱈魚片（編號DXYP）、鱈魚排（編號XYP）等50 份市售標稱為“鱈魚”的制品在本地超市、市場及餐飲店購得。

異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖、太平洋鱈、大西洋鱈、狹鱈、黑線鱈、小鱗犬牙南極魚、莫氏犬牙南極魚、裸蓋魚、藍鱈、綠青鱈、細鱗壯鱈、狹鱗庸鰈、阿根廷無須鱈、藍鰭金槍魚、黃鰭金槍魚、長鰭金槍魚、大目金槍魚、劍魚、鰹魚、鱸魚、鮐魚、大菱鲆、鯽魚、草魚、鳙魚、鯉魚、暗紋東方鲀、紅鰭東方鲀、旗魚、鱖魚、羅非魚、鮟鱇魚、鰱魚、大黃魚35 種實驗樣品由本室收集保存。

海洋動物組織DNA提取試劑盒 天根生化科技 （北京）有限公司；PremixExTaq（2×） 寶生物工程（大連）有限公司；引物與探針的合成及DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；Light Cycler 480實時熒光PCR儀 瑞士Hoffmann-La Roche有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；WH2微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；微量核酸蛋白測定儀 德國Implen公司。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA制備

取30 mg魚肉組織剪碎后置于1.5 mL離心管中，用海洋動物組織DNA提取試劑盒提取DNA，提取方法詳見試劑盒操作說明書。用微量核酸蛋白測定儀測定DNA濃度和純度，置于-20 ℃保存。

1.3.2 引物與探針的設計

表1 18 種鱈魚及其易混品種COI基因的代表性序列Table 1 Representative sequences of COI genes of 18 cod species and other species commonly used as adulterants

圖1 異鱗蛇鯖引物和探針位置圖 Fig. 1 Positions of the primers and probes for L. flavobrunneum

根據(jù)我國進出口以及或消費環(huán)節(jié)的調研，選擇異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖、大西洋鱈、太平洋鱈、狹鱈、黑線鱈、小鱗犬牙南極魚、莫氏犬牙南極魚、裸蓋魚、藍鱈、綠青鱈、細鱗壯鱈等18 個品種的“鱈魚”及其易摻假品種，在NCBI網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下載其COI基因的代表性序列（表1），用DNAMAN 8.0和BioEdit7.0軟件進行序列比對、輸出，針對異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖的物種特異性片段分別設計上、下游引物與探針，引物、探針位置見圖1、2，引物及探針序列見表2。

圖2 棘鱗蛇鯖引物和探針位置圖 Fig. 2 Positions of the primers and probes for R. pretiosus

表2 引物及探針序列Table 2 Sequences of primers and probes used in this study

1.3.3 反應體系及條件

反應體系：PremixExTaq（2×）12.5 μL；上游引物、下游引物（10 μmol/L）各0.55 μL；探針（10 μmol/L） 0.3 μL；DNA模板5 μL，用無菌水補至總體系為25 μL。

反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40 個循環(huán)，收集熒光信號，擴增曲線圖及擴增效率圖由real-time PCR儀的自帶軟件Light Cycler 480 SW1.5.1生成。

1.3.4 特異性分析

利用異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖的引物、探針及檢測方法，分別以異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖、大西洋鱈、太平洋鱈、狹鱈、黑線鱈、小鱗犬牙南極魚、莫氏犬牙南極魚、裸蓋魚、藍鱈、綠青鱈、細鱗壯鱈、狹鱗庸鰈、阿根廷無須鱈、金槍魚等35 種樣品DNA為模板，無菌水為空白對照，依照1.3.3節(jié)方法分別進行real-time PCR擴增，驗證方法的特異性。

1.3.5 靈敏度分析

1.3.5.1 絕對靈敏度

將提取的異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖DNA模板原液（質量濃度20 ng/μL）用無菌水分別進行10 倍梯度稀釋，即20、2、0.2、0.02、0.002、0.000 2 ng/μL和0.000 02 ng/μL 7 個質量濃度梯度，依照1.3.3節(jié)方法分別進行real-time PCR擴增，每個質量濃度設2 個平行。該實驗重復3 次，利用軟件SPSS 22.0計算Ct值的平均值、標準偏差和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5.2 相對靈敏度

將異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖肌肉組織分別與太平洋鱈肌肉組織以一定比例混合，制成異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖添加量分別為10%、5%、1%、0.1%、0.01%和0.001%的混合樣品，提取DNA，依照1.3.3節(jié)方法分別進行real-time PCR擴增，每個含量設2 個平行。該實驗重復3 次。

1.3.6 市售“鱈魚”制品檢測

利用本研究建立的方法對50 份市售“鱈魚”制品進行檢測，分析其中是否含有異鱗蛇鯖或棘鱗蛇鯖成分。樣本的真實性成分按GB/T 35918—2018《動物制品中動物源性檢測基因條碼技術 Sanger測序法》進行分析[11]。

2 結果與分析

2.1 樣品DNA

所有樣品的DNA質量濃度在20～70 ng/μL之間，A260nm/A280nm在1.8～2.0之間，滿足real-time PCR的要求。

2.2 特異性分析

基于異鱗蛇鯖特異性引物和探針建立的檢測方法對供試的35 種魚的DNA進行real-time PCR擴增，結果表明，該方法僅對異鱗蛇鯖有明顯擴增，Ct平均值為16.50，呈典型的陽性結果，其他被測DNA及空白對照在40 個循環(huán)內沒有擴增，呈典型的陰性結果（圖3）?；诩[蛇鯖特異性引物和探針建立的檢測方法對供試的35 種魚的DNA進行real-time PCR擴增，結果表明，該方法僅對棘鱗蛇鯖有明顯擴增，Ct平均值為15.54，呈典型的陽性結果，其他被測DNA及空白對照在40 個循環(huán)內沒有擴增，呈典型的陰性結果（圖3）。說明異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖的檢測方法均具有良好的特異性。

圖3 異鱗蛇鯖（A）和棘鱗蛇鯖（B）real-time PCR特異性分析Fig. 3 Specificity evaluation of real-time PCR for L. flavobrunneum (A) and R. pretiosus (B)

2.3 靈敏度分析

2.3.1 絕對靈敏度

圖4 異鱗蛇鯖（A）和棘鱗蛇鯖（B）real-time PCR絕對靈敏度Fig. 4 Absolute sensitivities of real-time PCR for L. flavobrunneum (A) and R. pretiosus (B)

圖5 異鱗蛇鯖（A）和棘鱗蛇鯖（B）real- time PCR擴增效率Fig. 5 Amplifciation effciiencies of real-time PCR for L. falvobrunneum (A) and R. pretiosus (B)

將質量濃度20～0.000 02 ng/μL的異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖DNA分別進行real-time PCR擴增，擴增曲線如圖4所示，擴增效率如圖5所示，得到標準曲線的斜率分別為 -3.412和-3.324；相關系數(shù)R2分別為0.995 7和0.995 3；根據(jù)擴增效率公式（擴增效率/%＝（10（-1/斜率）-1）× 100））得到異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖的擴增效率分別為96.38%、99.89%，均在可接受區(qū)間90%～110%內。

當異鱗蛇鯖DNA質量濃度為20～0.002 ng/μL時，均出現(xiàn)明顯的擴增曲線，當其低于0.002 ng/μL，擴增曲線在基線位置，說明異鱗蛇鯖的檢測方法靈敏度為0.002 ng/μL； 當 棘 鱗 蛇 鯖D N A 質 量 濃 度 為2 0 ～0.0 0 0 2 n g/μ L 時，出現(xiàn)明顯的擴增曲線，當其低于0.000 2 ng/μL，擴增曲線在基線位置，說明棘鱗蛇鯖的檢測方法靈敏度為0.000 2 ng/μL。

表3 real-time PCR重復性Table 3 Repeatability of the real-time PCR method

real-time PCR重復性見表3。隨著異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖樣品DNA含量降低，Ct值呈增高趨勢，異鱗蛇鯖5 個質量濃度樣品Ct值的標準偏差在0.10～0.74之間，RSD在0.61%～2.64%之間；棘鱗蛇鯖6 個質量濃度樣品Ct值的標準偏差在0.31～0.76之間，RSD在1.42%～2.50%之間，均在可接受范圍內。因此，本實驗建立的 real-time PCR檢測方法具有良好的重復性。

2.3.2 相對靈敏度

圖6 異鱗蛇鯖（A）和棘鱗蛇鯖（B）real-time PCR相對靈敏度檢測Fig. 6 Relative sensitivities of real-time PCR for L. flavobrunneum (A) and R. pretiosus (B)

利用建立的方法分別檢測混有不同質量比的異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖肌肉的太平洋鱈魚肉，擴增結果如圖6所示。當異鱗蛇鯖添加量在0.01%及以上時出現(xiàn)明顯的擴增曲線，當添加量低于0.01%時，熒光擴增曲線在基線位置，說明異鱗蛇鯖real-time PCR的檢測相對靈敏度為0.01%；當棘鱗蛇鯖添加量在0.01%及以上時出現(xiàn)明顯的擴增曲線，當添加量低于0.01%時，熒光擴增曲線在基線位置，說明棘鱗蛇鯖real-time PCR的檢測相對靈敏度也為0.01%。

2.4 市售“鱈魚”制品檢測結果

利用建立的real-time PCR法對50 份市售“鱈魚”制品進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)在1 份標稱“水鱈魚”的樣品中檢測出異鱗蛇鯖成分，在1 份標稱“水鱈魚”的樣品中檢測出棘鱗蛇鯖成分，與標簽不符，該結果與按GB/T 35918—2018的檢測結果一致（表4）。

表4 市售“鱈魚”制品中油魚成分檢測結果Table 4 Results of detection of R. pretiosus- and L. flavobrunneum- derived ingredients in commercial cod products

3 討 論

近年來，“以油充鱈”現(xiàn)象頻發(fā)，嚴重侵害了消費者的權益，擾亂了行業(yè)的的正常經營秩序，由此帶來的食品安全風險不容忽視。建立一種準確、快速的“油魚”檢測方法已經成為研究熱點。高值鱈魚的捕撈加工方式，決定了該類產品主要以去頭、去內臟、切段和切片的方式銷售，缺乏傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定所需的外部特征。因此多數(shù)研究者重點關注基于蛋白質、核酸等生物大分子的檢測方法。

Ochiai等[12]基于蛋白質分子質量的不同，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）技術對“油魚”進行鑒別。該方法將異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖、無須鱈及裸蓋魚等29 種魚類的可溶性肌肉蛋白分別進行SDS-PAGE分析，得到具有“油魚”物種特異性的蛋白指紋圖譜，從而將“油魚”與其他魚區(qū)分開。該方法雖具有檢測成本低、較準確的特點，但當魚肉經過加熱等環(huán)節(jié)后將導致部分特征性蛋白變性或降解，從而使原有的指紋圖譜發(fā)生變化，導致出現(xiàn)假陰性的結果[13]，因此該方法僅能對新鮮樣品進行鑒別。此外，該方法的靈敏度較低，對摻有“油魚”的魚肉混合樣品進行鑒別的分辨率有限，也限制了該方法的實際應用。

此外，由于大型分析儀器的快速發(fā)展，色譜分析技術在食品安全檢測方面的應用已較為廣泛，成功實現(xiàn)了鮭魚、鱘魚和金槍魚[14]等物種的鑒別，并呈現(xiàn)出高靈敏、高分辨等技術優(yōu)勢[15]。Ling等[7]利用蠟酯的極性低和熱穩(wěn)定性好的特點，通過氣相色譜-質譜聯(lián)用并結合薄層色譜技術分析異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖、大西洋鱈和裸蓋魚等30 個魚類樣品中的蠟酯成分。結果表明僅在異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖的樣品中存在C32～C36的蠟酯特征峰，熱處理樣本與新鮮樣本的分析結果一致，說明該方法可用于鑒定熱加工后的樣品。然而該類分析方法儀器成本較高，操作過程繁瑣，標準化與推廣應用前景均具有一定的局限性，一般不作為生物大分子靶標的首選檢測和仲裁鑒定方法[16]。

DNA在動物不同組織器官中完全相同，其完整性受食品加工過程的影響較小等優(yōu)點已成為物種鑒別的主要研究對象[16-18]。Park等[19]利用16S rRNA序列設計了兩對特異性引物，通過PCR結合測序比對檢測異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖成分，但該方法過程繁瑣、耗時長，在PCR產物處理過程中容易造成污染從而產生假陽性的結果。Dalama等[10]利用線粒體COI基因設計了一組特異性引物和探針，通過多重real-time PCR的方法鑒定“油魚”，該方法可以對異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖的同時檢測，無需PCR產物的后續(xù)處理等步驟。然而多重real-time PCR在擴增過程中各檢測通道波長容易互相干擾導致擴增效率降低，易產生假陽性結果等缺陷。real-time PCR方法具有準確度和靈敏度高、可靠性和特異性強、重現(xiàn)性好、操作簡便等優(yōu)勢[20-22]，目前已廣泛應用于食品中鮭科魚類[23]、轉基因鮭魚[24]以及大西洋鱈、太平洋鱈和狹鱈[25]等物種鑒別、食品原料摻假、成分檢測等領域，顯示了其良好的應用前景。

物種特異性基因片段的選擇是real-time PCR法進行物種鑒別的關鍵。本研究在預實驗中針對16S rRNA、COI和Cyt b等基因分別設計了異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖的物種特異性引物與探針，在驗證了各個靶標的特異性后最終選定針對COI基因設計的特異性引物及探針。線粒體COI基因具有結構簡單、相對保守、覆蓋了更廣泛的分類單元，進化速率和長度適中等優(yōu)點，廣泛用于海洋生物的的鑒定和分類[26]。許多學者將線粒體COI基因用于動物尤其是魚類的鑒別研究中[27-30]。此外，COI基因還被成功應用于鑒別市場上出售的食用魚片真?zhèn)蝃31]。

本研究建立的real-time PCR檢測方法具有很好的重復性，最低可檢出0.002 ng/μL（異鱗蛇鯖）和0.000 2 ng/μL （棘鱗蛇鯖）的目標DNA，與Dalama等[10]建立的多重real-time PCR方法檢出限為0.003 ng/μL（異鱗蛇鯖）和0.004 ng/μL（棘鱗蛇鯖）相比具有一定優(yōu)勢。本研究還將異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖魚肉與太平洋鱈魚肉按不同比例混合，模擬摻雜使假的樣本，評價檢測方法的相對靈敏度。結果表明，兩個方法相對靈敏度均可達0.01%，即在1 kg魚肉中添加0.1 g異鱗蛇鯖或棘鱗蛇鯖魚肉也可被本方法檢測出來，說明該方法不僅可以檢測魚段、魚片的原料是否為“油魚”，而且可以檢測魚糜等制品中是否摻雜“油魚”肉，顯示了該方法具有良好的應用前景。此外，為了驗證本方法的實用性，利用兩種方法分別對50 份市售“鱈魚”制品進行檢測，有2 份樣品分別檢出了異鱗蛇鯖、棘鱗蛇鯖的成分，并且檢測結果與傳統(tǒng)的測序結果一致，表明本方法具有良好的準確性及實際應用價值。同時也在一個側面反映出，盡管主管部門不斷加強監(jiān)管，市面上仍有用“油魚”假冒鱈魚的情況，本方法為主管部門精準監(jiān)管、精準執(zhí)法，保護消費者權益，保障食品安全，維護水產行業(yè)的健康良性發(fā)展提供了可靠的技術支撐。