黑白胡椒臘腸貯藏期中氣味活性物質(zhì)演變及異味分析

周慧敏，趙 冰，吳倩蓉，李 素，潘曉倩，朱 寧，喬曉玲，王守偉，劉博文，張順亮

（中國(guó)肉類(lèi)食品綜合研究中心，肉類(lèi)加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

臘腸屬于我國(guó)傳統(tǒng)腌臘肉制品，黑白胡椒是一種常用的調(diào)味品，一般黑胡椒的味道比白胡椒濃烈，白胡椒的味道更加柔和、清香，且香味比較穩(wěn)定，不易散失；而白胡椒辛辣味更甚，所以驅(qū)寒效果更佳，調(diào)味效果稍差，常常配伍使用可達(dá)到風(fēng)味和食療功效最佳的效果，因此黑白胡椒風(fēng)味的臘腸廣泛受到消費(fèi)者的喜愛(ài)。臘腸由于其水分活度低和防腐劑、色素、調(diào)味料、抗氧化劑的使用，一般擁有長(zhǎng)達(dá)6～10 個(gè)月的貨架期。臘腸若貯藏不當(dāng)會(huì)縮短貨架期，主要受氧化現(xiàn)象引起的感官惡化影響，因?yàn)橹虏【蚋瘮【茈y在臘腸中繁殖[1-3]。風(fēng)味是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，也是消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)時(shí)所參考的重要因素，還可預(yù)測(cè)產(chǎn)品的貨架期。研究認(rèn)為，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，腌臘肉制品的風(fēng)味會(huì)逐漸發(fā)生變化，從而導(dǎo)致可接受性的喪失。在貯藏期中風(fēng)味的劣變一般早于其他感官品質(zhì)的變化[4-5]。酸敗和哈喇味是其風(fēng)味惡化的主要原因，而其他可能形成的異味，如霉味、金屬味、腐臭味或辛辣味，是導(dǎo)致食用品質(zhì)喪失的次要原因[6-7]。

風(fēng)味惡化的原因較復(fù)雜，一方面是由于導(dǎo)致異味的風(fēng)味化合物的形成或濃度增加，另一方面是由于腌制液、胡椒和其他香辛料、調(diào)味料等賦予的香味化合物的降解或逸失。通過(guò)監(jiān)測(cè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化可以解析臘腸在貯存期間氣味的改變[8-10]。同時(shí)貯藏期間發(fā)生的理化反應(yīng)（氨基酸的Strecker降解、美拉德反應(yīng)、脂肪水解氧化等）也可以通過(guò)檢測(cè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指示。在眾多品種的臘腸中基本包括醛類(lèi)、酮類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)、烷烴和萜烯等揮發(fā)性化合物[1]。根據(jù)其可能的來(lái)源分為香料（萜烯類(lèi)和脂肪族硫化合物）、脂質(zhì)氧化（醛類(lèi)、烴類(lèi)、醇類(lèi)和酮類(lèi)）、微生物酯化和料酒（如乙酸丙酯、丙酸乙酯和己酸乙酯）、碳水化合物發(fā)酵（如1,3-丁二醇和苯乙醛）、氨基酸分解代謝（如2-甲基丁醛、2-甲基-1-丁醇和2,3-丁二醇）、其他來(lái)源以及這些因素之間的交互反應(yīng)[11-13]。而干腌腸貯藏中出現(xiàn)的酸敗與脂質(zhì)氧化過(guò)程中醛、酮和羧酸的形成有關(guān)，在較小程度上與游離氨基酸，如賴氨酸、酪氨酸或天冬氨酸的產(chǎn)生有關(guān)。

國(guó)內(nèi)針對(duì)臘腸的品質(zhì)保持研究已有較多報(bào)道，如添加天然抗氧化劑、香辛料、調(diào)味料、發(fā)酵劑等及包裝、貯藏溫度的篩選[2,14-18]。且對(duì)不同類(lèi)型臘腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，如唐玲[19]檢測(cè)廣式臘腸中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為乙醇和短鏈乙酯類(lèi)，占總揮發(fā)性物質(zhì)的80%左右。宋永等[20]檢測(cè)哈爾濱風(fēng)干腸中最主要的風(fēng)味化合物為己酸乙酯，其次為乙醇、己醛和丁酸乙酯。張大革等[21]檢測(cè)傳統(tǒng)發(fā)酵干香腸中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為酯類(lèi)占42.07%、醛類(lèi)占31.22%。不同種類(lèi)的臘腸主體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間存在一定差異，并不是所有風(fēng)味物質(zhì)對(duì)產(chǎn)品整體風(fēng)味有貢獻(xiàn)，氣味活性化合物的確定是食品風(fēng)味研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。另外目前針對(duì)風(fēng)干腸、廣式香腸風(fēng)味劣變的原因也有一些報(bào)道，研究認(rèn)為脂肪過(guò)度氧化產(chǎn)生較多的醛、酮類(lèi)物質(zhì)，對(duì)臘腸風(fēng)味造成負(fù)面 影響[12,18-19]；吳倩榮等[22]檢測(cè)風(fēng)干腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為酯類(lèi)物質(zhì)，經(jīng)氣味活性值（odour activity value，OAV）分析以及氣相色譜-嗅聞（gas chromatographyolfactometry，GC-O）鑒定，辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、E,E-2,4-癸二烯醛可能是造成風(fēng)干腸異味的主要物質(zhì)。但針對(duì)黑白胡椒臘腸在貯藏過(guò)程中氣味活性物質(zhì)演變規(guī)律、異味解析及貨架期評(píng)價(jià)的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)采用吹掃捕集-熱脫附-氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（purge & trap-thermal desorption-gas chromatographyolfactometry-mass spectrometry，P&T-TDS-GC-O-MS）聯(lián)用對(duì)不同貯藏時(shí)間的黑白胡椒臘腸樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，結(jié)合OAV、感官評(píng)價(jià)和相關(guān)性分析，研究貯藏過(guò)程中黑白胡椒臘腸的氣味活性化合物的演變規(guī)律，以及解析異味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）和二維聚類(lèi)熱圖分析，建立風(fēng)味劣變和貨架期預(yù)測(cè)的有效評(píng)價(jià)手段，以期為臘腸風(fēng)味保持和異味控制技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供支持，為優(yōu)化其貯藏條件及提高風(fēng)味品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬4號(hào)肉、豬背脂 北京中瑞食品有限公司；臘腸輔料 北京美添前景科技有限公司；2-甲基-3-庚酮標(biāo)準(zhǔn)品、C8～C20正構(gòu)烷烴 美國(guó)Sigma公司；C10～C25正構(gòu)烷烴 上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

0SCAR 20型灌腸機(jī) 德國(guó)海因里希弗雷機(jī)械制造有限公司；BYXX-50煙熏爐 中國(guó)艾博有限公司；Gerstel TDS-3半自動(dòng)熱脫附進(jìn)樣器、TC-200型多吸附管老化儀、Tenax-TA吸附管、嗅聞儀 德國(guó)Gerstel 公司；吹掃捕集制樣瓶 自制；TRACE1310-TSQ8000 GC-MS聯(lián)用儀、TG-Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臘腸制作和取樣

產(chǎn)品配方：原料（4號(hào)肉∶背脂=4∶1）；配料（根據(jù)原料質(zhì)量按比例添加）：亞硝酸鈉0.003%、鹽2%、白砂糖1%、葡萄糖0.5%、味精0.1%、白胡椒0.1%、黑胡椒0.15%、異抗壞血酸鈉0.15%、冰水10%。

工藝流程：分別將剔除筋膜的豬瘦肉和背脂切塊，通過(guò)8 mm孔板的絞肉機(jī)絞碎→按比例添加配料和原料攪拌→灌腸（膠原蛋白腸衣，23 mm）→打結(jié)（10 cm）→風(fēng)干（45 ℃，48 h）→冷卻→包裝（常壓密封包裝）→后熟7 d（常溫）→成品→貯藏。

取樣：將黑白胡椒臘腸成品在37 ℃干燥箱中貯藏，分別在貯藏的第0、7、21、35、49、77天，共6 個(gè)點(diǎn)取樣。黑白胡椒臘腸在貯藏第77天的樣品顏色變黑，臘味香味喪失，異味非常強(qiáng)烈，完全不可接受，故貯藏至77 d后停止實(shí)驗(yàn)；挑戰(zhàn)性貯藏（37 ℃有氧條件）是為了加速臘腸的氧化變質(zhì)，以解析異味的主要風(fēng)味化合物[22]。

1.3.2 P&T提取揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

在室溫條件下將臘腸用破壁機(jī)切碎混勻，準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g樣品置于樣品瓶中，加入1 μL 2-甲基-3-庚酮標(biāo)準(zhǔn)品（0.816 μg/μL）作為內(nèi)標(biāo)物，旋緊瓶蓋，55 ℃平衡10 min；樣品瓶的一端通氮?dú)猓祾吡魉贋?0 mL/min，另一端用已老化的TA吸附管富集臘腸的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，55 ℃吸附40 min后，取出吸附管用氮?dú)夥创?0 min去除水分，之后在熱脫附進(jìn)樣口進(jìn)樣，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次取平均值[23]。

1.3.3 TDS-GC-MS測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)程序[24]

T D S 程序：采用標(biāo)準(zhǔn)加熱模式，氦氣流速 20 mL/min，不分流；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持0.1 min；以40 ℃/min上升到210 ℃，保持5 min；傳輸線溫度215 ℃。

冷進(jìn)樣條件：采用標(biāo)準(zhǔn)加熱模式；液氮冷卻；升溫程序：初始溫度-100 ℃，平衡0.1 min；以10 ℃/min升到215 ℃，保持5 min；分流比為30∶1。

GC條件：TG-Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）提前凈化；高純氦氣（純度＞99.99%）為載氣；流速1.5 mL/min；不分流進(jìn)樣模式，保持1 min。升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min速率升溫至200 ℃，8 ℃/min速率升溫至230 ℃，保持3 min。

MS條件：電子電離源，溫度280 ℃；傳輸線溫度230 ℃；電子能量70 eV；全掃描模式：質(zhì)量掃描范圍 m/z 40～600。

1.3.4 嗅聞檢測(cè)[13,22]

揮發(fā)性風(fēng)味混合物經(jīng)GC分離后通過(guò)三通器分別進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器和嗅聞檢測(cè)器，分流比為1∶1，嗅聞傳輸線溫度為200 ℃。選取3 名嗅覺(jué)靈敏，并經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的人員在嗅聞口進(jìn)行嗅聞，記錄所聞到的氣味保留時(shí)間、氣味特征以及氣味強(qiáng)度。強(qiáng)度分為5 個(gè)等級(jí)（1=氣味非常微弱、2=氣味微弱、3=氣味中等、4=氣味強(qiáng)烈、5=氣味非常強(qiáng)烈）。每種風(fēng)味化合物的氣味描述以及時(shí)間須由至少2 名評(píng)價(jià)員確認(rèn)一致，則將該描述記為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

定性分析[22]：將色譜圖中的化合物與NIST、Wiley等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，化合物的確定以正匹配和反匹配均大于700為準(zhǔn)。并且利用系列正夠烷烴在相同升溫條件下的保留時(shí)間計(jì)算待測(cè)化合物的保留指數(shù)（retention index，RI），與文獻(xiàn)值[25]進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合嗅聞結(jié)果對(duì)貯藏期的臘腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

定量分析：根據(jù)化合物峰面積與含量的比值為定值，計(jì)算每一種風(fēng)味化合物相對(duì)于內(nèi)標(biāo)物的含量，按式（1）計(jì)算未知揮發(fā)性化合物含量：

其中：CX為未知揮發(fā)性化合物含量/（μg/kg）；AX為未知揮發(fā)性化合物的峰面積/（AU·min）；C0為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度/（μg/μL）；A0為內(nèi)標(biāo)的峰面積/（AU·min）；V為內(nèi)標(biāo)的加樣量/μL；m為樣品的質(zhì)量/g。

1.3.6 OAV的計(jì)算

采用OAV評(píng)價(jià)各化合物對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)[26]；風(fēng)味閾值通過(guò)查閱文獻(xiàn)[27]，按式（2）計(jì)算OAV：式中：C為揮發(fā)性化合物含量/（μg/kg）；T為該物質(zhì)在水中的察覺(jué)閾值/（μg/kg）。

1.3.7 感官分析

對(duì)不同貯藏時(shí)間點(diǎn)的黑白胡椒臘腸進(jìn)行定量描述感官評(píng)價(jià)，參照GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范》[28]的要求，制定感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選取10 名經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的感官評(píng)價(jià)員，將臘腸切成2 mm左右厚的薄片，感官評(píng)價(jià)實(shí)行10 分制原則，總分為30 分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 如表1所示。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Chinese sausage

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對(duì)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、RI等數(shù)值進(jìn)行計(jì)算以及繪圖；利用SPSS 21.0對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan單因素顯著性差異分析以及Pearson相關(guān)性分析。采用UnscrambX 10.1軟件對(duì)不同貯藏時(shí)間臘腸樣品組中風(fēng)味活性化合物（OAV≥1）進(jìn)行PCA。再利用Heatmapper網(wǎng)絡(luò)在線軟件對(duì)不同貯藏時(shí)間臘腸樣品組和風(fēng)味活性化合物（OAV≥1）基于歐氏距離采用平均連接法同時(shí)進(jìn)行二維聚類(lèi)分析，并繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏時(shí)間對(duì)黑白胡椒臘腸感官評(píng)價(jià)的影響

表2 不同貯藏時(shí)間黑白胡椒臘腸感官評(píng)分Table 2 Sensory evaluation results of Chinese sausages added with black and white pepper at different times of storage

由表2可知，樣品的色澤和整體接受度得分在貯藏前7 d無(wú)顯著變化，之后隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均顯著下降（P＜0.05）。 臘腸的色澤逐漸從亮紅色（成品和貯藏7 d） 到暗紅色（貯藏21 d），褐色（35～49 d），最終為黑色（77 d），這是由于貯藏過(guò)程中亞硝基肌紅蛋白逐漸被氧化造成的，這與吳倩蓉等[22]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。臘腸的風(fēng)味得分在貯藏的前7 d略有增加，之后逐漸降低。這可能是由于貯藏前期脂肪水解氧化、氨基酸降解和微生物代謝等繼續(xù)產(chǎn)生臘腸的特征化合物，因此在貯藏第7天臘味更加濃郁。而之后臘香味和胡椒味逐漸減弱（21 d），略有異味（35 d），最終異味強(qiáng)烈和酸敗味明顯（49～77 d）。風(fēng)味劣變，產(chǎn)生異味、哈敗味，可能來(lái)源于脂肪氧化變質(zhì)、氨基酸過(guò)度降解，因?yàn)榈蜐舛葧r(shí)具有正向風(fēng)味貢獻(xiàn)的化合物在高濃度時(shí)可能變成異味。臘腸整體接受度得分與色澤、風(fēng)味相一致，在貯藏的前7 d樣品有較高評(píng)分，其色澤、風(fēng)味均處于最佳狀態(tài)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢降低，而在貯藏第35天時(shí)色澤變褐，出現(xiàn)異味，為品質(zhì)劣變的臨界點(diǎn)，表明到達(dá)貨架期的終點(diǎn)，之后產(chǎn)品劣變程度加速，變得不可接受。

2.2 黑白胡椒臘腸在貯藏過(guò)程中風(fēng)味活性物質(zhì)的演變規(guī)律

采用P&T-TDS-GC-MS聯(lián)合技術(shù)和RI比對(duì)檢測(cè)不同貯藏時(shí)間的黑白胡椒臘腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共鑒定出106 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，但其對(duì)產(chǎn)品總體風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)度是由風(fēng)味體系中揮發(fā)性物質(zhì)的濃度與感覺(jué)閾值共同決定的。一般認(rèn)為，OAV≥1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為樣品的風(fēng)味活性化合物，對(duì)整體風(fēng)味有直接影響，且OAV越大該化合物對(duì)整體氣味的貢獻(xiàn)就越大。 0.1≤OAV＜1的組分被認(rèn)為對(duì)樣品的總體風(fēng)味具有重要的修飾作用[26,28]。因此進(jìn)一步計(jì)算全部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的OAV，得到56 種OAV≥0.1的化合物，如表3所示，醛類(lèi)（15 種）最多，其次為烯烴類(lèi)（9 種）、酯類(lèi)（8 種）、酮類(lèi)（7 種）、醇類(lèi)（6 種）、其他雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)（6 種）和酸類(lèi)（5 種）。在不同貯藏時(shí)間6 組樣品中檢出OAV≥0.1的風(fēng)味物質(zhì)分別為37、39、38、39、40、40 種，說(shuō)明貯藏前期揮發(fā)性化合物（OAV≥0.1）種類(lèi)持續(xù)增加，中期保持穩(wěn)定。由圖1可知，OAV總和分別為2 008.93、2 507.20、2 982.08、3 958.29、4 675.89、5 474.35。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，風(fēng)味物質(zhì)的OAV總和逐漸增加，與成品比較（貯藏0 d），前21 d貯藏期的樣品總OAV增加不顯著，但在貯藏第35天時(shí)，總OAV增加顯著。其中醛類(lèi)物質(zhì)OAV占比最高，占85.85%～90.35%。除酯類(lèi)和烯烴類(lèi)物質(zhì)，各類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的OAV隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，均持續(xù)增加，與成品比較，尤其在貯藏35～49 d之間增加最顯著。而酯類(lèi)的OAV在貯藏第14天出現(xiàn)了最低點(diǎn)，在其他貯藏時(shí)間點(diǎn)OAV持續(xù)增加。烯烴類(lèi)在整個(gè)貯藏過(guò)程中OAV基本穩(wěn)定。

表3 黑白胡椒臘腸在貯藏過(guò)程中氣味活性化合物的OAVTable 3 OAVs of various odor-active compounds in Chinese sausages added with black and white pepper during storage

續(xù)表3

圖1 各類(lèi)氣味活性物質(zhì)不同貯藏時(shí)間的OAV（A）和 OAV在不同貯藏時(shí)間的占比（B）Fig. 1 Actual (A) and percent (B) OAVs of various classes of odoractive compounds at different storage time points

2.2.1 風(fēng)味活性醛類(lèi)物質(zhì)

由表3可知，黑白胡椒臘腸成品中風(fēng)味活性醛類(lèi)物質(zhì)的OAV最高，達(dá)1 724.58，對(duì)成品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率高達(dá)85.85%，其中主要是源于脂肪氧化的直鏈醛類(lèi)，占98.76%，被認(rèn)為是影響樣品整體風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)物。直鏈醛包括直鏈飽和醛（戊醛、己醛、庚醛等）、2-直鏈烯醛（順-2-庚烯醛）和2,4-直鏈二烯醛（2,4-壬二烯醛醛）。如圖2所示，直鏈飽和醛和2-直鏈烯醛在貯藏過(guò)程中持續(xù)增加，在貯藏末期（77 d）時(shí)其OAV分別是成品的4.75 倍和3.57 倍，而2,4-直鏈二烯醛的OAV在貯藏的前35 d持續(xù)增加近1 倍，之后趨于平緩，這主要由 反,反-2,4-癸二烯醛所主導(dǎo)，在肉制品中賦予油炸味。根據(jù)OAV的大小，醛類(lèi)物質(zhì)中對(duì)成品風(fēng)味貢獻(xiàn)度最大的為反,反-2,4-癸二烯醛（1 005.25），其次是己醛（388.07）、庚醛（110.15）、反,反-2,4-壬二烯醛（65.02）、反-2-辛烯醛（63.99）、壬醛（48.73）等。

直鏈飽和醛，如戊醛具有辛辣味，己醛具有青草味，庚醛具有脂肪味，壬醛和辛醛具有油脂氣味、清新味。這些飽和醛在貯藏過(guò)程中顯著增加，在貯藏第77天樣品OAV是成品的3～7 倍。反-2-辛烯醛和反-2-癸烯醛賦予樣品堅(jiān)果味、牛油味，這2 種對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的2-直鏈烯醛在貯藏過(guò)程中也顯著增加，在貯藏第77天OAV是成品的3～4 倍。這些醛類(lèi)物質(zhì)濃度較小時(shí)，具備清香、脂肪的氣味，對(duì)成品的香氣起積極的作用；濃度較大時(shí)，則會(huì)變成異味。文獻(xiàn)[29-31,11-12]研究報(bào)道，庚醛、辛醛、壬醛來(lái)源于油酸的自動(dòng)氧化；己醛、反-2-辛烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛是亞油酸自動(dòng)氧化的主要產(chǎn)物，戊醛是13-亞油酸過(guò)氧化氫的熱解產(chǎn)物；其他醛類(lèi)如反-2-辛醛、反-2-癸烯醛和反,反-2,4-壬二烯醛也來(lái)源于其他脂類(lèi)的氧化。說(shuō)明脂肪氧化反應(yīng)對(duì)產(chǎn)品的異味具有很大的貢獻(xiàn)作用。

其他少量的非脂肪族醛類(lèi)，如2-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛、4-乙基苯甲醛，源于支鏈氨基酸和苯丙氨酸的Strecker降解或微生物代謝[11]，主要貢獻(xiàn)巧克力、杏仁和焦糖味。除4-乙基苯甲醛，其他的氨基酸代謝醛類(lèi)均在成品中檢到，且隨著貯藏期的延長(zhǎng)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，尤其是2-甲基丁醛和苯乙醛在貯藏后期（35 d后）增加顯著，OAV達(dá)到50左右。說(shuō)明在貯藏過(guò)程中氨基酸代謝反應(yīng)對(duì)產(chǎn)品后期異味的生成有一定貢獻(xiàn)。

圖2 各類(lèi)直鏈醛類(lèi)OAV在不同貯藏時(shí)間的變化Fig. 2 Changes in OAVs of various straight-chain aldehydes at different storage time points

2.2.2 風(fēng)味活性醇類(lèi)物質(zhì)

黑白胡椒臘腸成品中醇類(lèi)物質(zhì)的OAV占比次高，為169.72，對(duì)成品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率為8.45%，樣品在貯藏過(guò)程中分別檢出4、3、5、5、5、3 種風(fēng)味活性醇類(lèi)化合物，除了芳樟醇，其他大部分均為源于脂肪氧化的正構(gòu)醇。其中對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的為芳樟醇（154.97）和1-辛烯-3-醇（13.04）。具有薰衣草香的芳樟醇經(jīng)常在黑白胡椒的揮發(fā)性氣味中被發(fā)現(xiàn)[32]，在貯藏過(guò)程中增加不顯著（P＞0.05）。而具有蘑菇氣味的1-辛烯-3-醇被普遍認(rèn)為是花生四烯酸中12-過(guò)氧化氫的氧化產(chǎn)物[29]，在貯藏過(guò)程中顯著增加（P＜0.05），貯藏的第77天OAV為111.55，增幅達(dá)到7.5 倍，是異味產(chǎn)生的主要因子。這與其他 研究[22,33]結(jié)果相似，但在半發(fā)酵香腸中未檢到[34-35]。

2.2.3 風(fēng)味活性酯類(lèi)物質(zhì)

雖然黑白胡椒風(fēng)干腸成品中酯類(lèi)物質(zhì)含量較低，但由于其風(fēng)味閾值較低，因此對(duì)成品整體風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)，為3.58%。樣品在貯藏過(guò)程中分別檢出5、6、6、6、5、7 種風(fēng)味活性酯類(lèi)化合物，多為C2～C10羧酸乙酯類(lèi)和內(nèi)酯類(lèi)。一方面可能源自脂肪氧化產(chǎn)生的羧酸與醇，或與微生物代謝產(chǎn)生的小分子酸、醇發(fā)生酯化反應(yīng)，另一方面脂肪水解產(chǎn)生的游離脂肪酸可能發(fā)生酯化反應(yīng)或是羥基脂肪酸水解后生成羥基酸，經(jīng)過(guò)加熱脫水、環(huán)化生成內(nèi)酯，酯類(lèi)物質(zhì)賦予風(fēng)干腸水果香氣[25]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，酯類(lèi)物質(zhì)OAV呈現(xiàn)先減少，21 d后呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，這主要由OAV最高的異戊酸乙酯主導(dǎo)。在加工后期酯類(lèi)物質(zhì)的增加可以掩蓋異味。酯類(lèi)物質(zhì)在貯藏過(guò)程中的變化趨勢(shì)與其他研究者[22]的研究結(jié)果相似，但酯類(lèi)物質(zhì)對(duì)產(chǎn)品的貢獻(xiàn)度差別很大，這主要由于產(chǎn)品制作配料的差異。Lorenzo等[35]在半干發(fā)酵香腸中檢測(cè)到的酯類(lèi)物質(zhì)為甲酯類(lèi)，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少。

2.2.4 風(fēng)味活性酮類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)

酮類(lèi)和酸類(lèi)對(duì)成品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率分別為0.63%和0.30%，在貯藏過(guò)程中顯著增加2～4 倍（P＜0.05）。不同樣品組中，分別檢測(cè)到酮類(lèi)物質(zhì)3、4、4、5、4、4 種，主要是2-庚酮、3-羥基-2-丁酮，在大部分腌臘制品中均為特征性風(fēng)味化合物。酮類(lèi)化合物可能是由多不飽和脂肪酸的熱氧化或降解產(chǎn)生的[29,33]。烯酮有一種甜味和水果味，如甲基庚烯酮在貯藏中后期未檢出。而二酮通常有肉和奶油味[29,36]，如2,3-戊二酮在貯藏后期檢測(cè)到。 3-羥基-2-丁酮存在于烤煙葉、奶油、可可、水果中，有令人愉快的奶油香味，僅在成品中檢到。值得注意的是，貯藏過(guò)程中顯著增加的是甲基酮、2-庚酮和2-壬酮，具有肥皂、干酪味，可能是異味的貢獻(xiàn)者。有研究報(bào)道，不飽和脂肪酸，亞麻酸、亞油酸、花生四烯酸氧化生成己醛、戊醛、辛醛、壬醛等直鏈醛，還有甲基酮[32]。

中鏈偶數(shù)脂肪酸被認(rèn)為是奶酪風(fēng)味的直接因素，因?yàn)樗鼈兊母兄撝岛艿?。長(zhǎng)鏈游離脂肪酸（大于12的碳原子）對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)很小[37]。風(fēng)干腸成品中OAV大于0.1的酸類(lèi)物質(zhì)包括丁酸、戊酸、己酸、癸酸等，來(lái)源于脂質(zhì)降解或氧化。每種短鏈脂肪酸都有獨(dú)特的風(fēng)味。例如，丁酸有腐臭和奶酪味，而己酸有辛辣味，戊酸有腐臭味[25]。 在貯藏過(guò)程中這些酸類(lèi)OAV顯著增加，其中，己酸和戊酸在貯藏第77天后分別增了3.20 倍和5.53 倍。另外，支鏈酸類(lèi)，3-甲基丁酸有酸味和汗臭味，且在貯藏末期OAV顯著提高，這些酸類(lèi)可能也是異味的貢獻(xiàn)者。

2.2.5 風(fēng)味活性烯烴類(lèi)物質(zhì)和雜環(huán)類(lèi)化合物

烯烴類(lèi)對(duì)成品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率為0.5%，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，貢獻(xiàn)率逐漸降低。烯烴類(lèi)物質(zhì)主要為d-檸檬烯和石竹烯，d-檸檬烯具有柑橘、薄荷味，石竹烯具有木香味。烯烴類(lèi)來(lái)源于產(chǎn)品制備時(shí)加入的黑白胡椒[38-39]。不同樣品組中還檢測(cè)出一些OAV大于0.1含氮含氧雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)，如茴香腦、2-丁基呋喃、2-戊基呋喃、均三甲苯、鄰-異丙基苯和2,3,5-三甲基吡嗪。其中成品中茴香腦和鄰-異丙基苯OAV較高，這可能來(lái)源于制作過(guò)程中所添加的香辛料，在整個(gè)貯藏過(guò)程中基本無(wú)變化。2-戊基呋喃存在大多數(shù)腌臘肉制品中，是亞油酸二次氧化的產(chǎn)物[29]，具有綠豆和黃油的氣味，在貯藏前21 d中增加不顯著，之后顯著增加，增量約是成品的50 倍。另外2-丁基呋喃僅在貯藏末期檢測(cè)到，因此這2 種呋喃類(lèi)被認(rèn)為是異味的因子。2,3,5-三甲基吡嗪是黑白胡椒臘腸中唯一的含氮雜環(huán)化合物，是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，具有奶油香味，在貯藏前期OAV為0.1～0.2，貯藏末期未檢測(cè)到，說(shuō)明貯藏后期美拉德反應(yīng)降低，這可能由于貯藏后期產(chǎn)品水分活度降低抑制了反應(yīng)的進(jìn)行。

2.3 貯藏時(shí)間、風(fēng)味感官評(píng)分與風(fēng)味活性物質(zhì)之間的相關(guān)性

表4 貯藏時(shí)間、風(fēng)味感官評(píng)分與風(fēng)味活性物質(zhì)的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 4 Pearson’s correlation coefficients of odor active compounds with storage time and sensory flavor score

表4僅列出了與貯藏時(shí)間、風(fēng)味感官評(píng)分顯著相關(guān)（P＜0.05）的氣味活性物質(zhì)，表3中56 種風(fēng)味有17 種化合物，如醛類(lèi)（2-甲基丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛）、醇類(lèi)（1-辛烯-3-醇、芳樟醇）、酮類(lèi)（2-庚酮）、酸類(lèi)（戊酸、己酸、3-甲基丁酸）、酯類(lèi)（異戊酸乙酯、癸酸乙酯）和2-戊基呋喃，這些風(fēng)味物質(zhì)的OAV與貯藏時(shí)間呈顯著正相關(guān)（R=0.828～0.988），并與風(fēng)味感官評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.979～-0.844），同時(shí)貯藏時(shí)間與風(fēng)味評(píng)分也顯著負(fù)相關(guān)。這表明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，這些風(fēng)味物質(zhì)的濃度也增加，同時(shí)風(fēng)味也逐漸惡化，因此這17 種化合物是貯藏時(shí)間和風(fēng)味惡化的最佳預(yù)測(cè)指標(biāo)。

2.4 黑白胡椒臘腸主體特征風(fēng)味和異味解析

表5 GC-O法鑒定不同貯藏時(shí)間黑白胡椒臘腸中的香氣特征Table 5 Aroma characteristics identified by GC-O of Chinese sausages added with black and white pepper at different storage time points

GC-O技術(shù)是將GC分離化合物的能力與人的嗅覺(jué)相結(jié)合，以更好地鑒定氣味活性物質(zhì)及其對(duì)總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)。由表5可知，反,反-2,4-癸二烯醛、己醛、芳樟醇、庚醛、反,反-2,4-壬二烯醛、反-2-辛烯醛和異戊酸乙酯的氣味強(qiáng)度較大，對(duì)黑白胡椒臘腸成品貢獻(xiàn)脂肪味、油炸味、青草味、果香、花香、奶油味等香氣特征，因此這些化合物是臘腸成品的主體特征風(fēng)味物質(zhì)，這與OAV結(jié)果基本一致。這些化合物來(lái)源于脂肪氧化、胡椒和酯化反應(yīng)，表明一定程度的油脂氧化構(gòu)成黑白胡椒臘腸香味的基本特征。

食物風(fēng)味劣變可能是由于對(duì)食物產(chǎn)生負(fù)面影響的揮發(fā)性成分的濃度增加產(chǎn)生的，也可能是由于香味物質(zhì)的損失，或者是這2 種影響的綜合結(jié)果。在本研究中，除了具有薯?xiàng)l味的未知物和宜人的花香、檸檬味的胡椒源化合物（芳樟醇、石竹烯、茴香腦、d-檸檬烯、月桂烯、β-蒎烯等）氣味強(qiáng)度降低或保持恒定外，脂肪氧化源氣味在貯藏的樣品中均有所增加。在貯藏末期氣味最強(qiáng)烈的化合物是己醛、反,反-2,4-癸二烯醛、庚醛、辛醛、反-2-辛烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和反-2-癸烯醛，在產(chǎn)品中具有深度油炸味和酸敗味。結(jié)合OAV分析、感官評(píng)價(jià)及相關(guān)性分析結(jié)果可知，這8 種化合物的OAV均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，嗅聞到該化合物氣味強(qiáng)度增強(qiáng)，產(chǎn)品的風(fēng)味逐漸惡化，與風(fēng)味感官評(píng)分顯著負(fù)相關(guān)，因此推測(cè)這8 種化合物在貯藏過(guò)程中氣味的強(qiáng)度大量增加打破了產(chǎn)品微妙的風(fēng)味平衡，是黑白胡椒臘腸貯藏過(guò)程中風(fēng)味劣變的主要原因。

2.5 基于OAV大于1風(fēng)味活性化合物的PCA和聚類(lèi)分析

PCA法是一種通過(guò)降維技術(shù)將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)PC的實(shí)用統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠最大程度地反映原始變量所包含的信息，簡(jiǎn)化原來(lái)的多維問(wèn)題。

基于篩選出的主體風(fēng)味成分，采用PCA法對(duì)不同貯藏時(shí)間點(diǎn)的臘腸進(jìn)行分析，得到不同貯藏時(shí)間臘腸中主體風(fēng)味成分的得分圖（圖3A）與相關(guān)性載荷圖 （圖3B）。由圖3A可知，PC1貢獻(xiàn)率為86%，PC2貢獻(xiàn)率為12%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到98%，表明PC1、PC2能夠較好地反映樣品特征。除貯藏49 d和77 d的樣品在第1象限有重疊，其他貯藏點(diǎn)的4 組樣品均沒(méi)有重疊。與感官評(píng)價(jià)結(jié)果基本相同，說(shuō)明基于風(fēng)味活性化合物PCA分析能夠?qū)⒉煌A藏時(shí)間的臘腸樣品判別出來(lái)。不同樣品在圖3A中的分布呈現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品分布依次從第3象限移動(dòng)到第2象限，再移動(dòng)到第1象限，最后移動(dòng)到第4象限，且樣品PC1的得分從負(fù)方向依次移動(dòng)到正方向。貯藏35 d前的樣品分布在PC1負(fù)方向，而貯藏35 d后的樣品分布在PC1正方向，因此貯藏35 d為樣品風(fēng)味惡化的分界，與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。

變量的載荷系數(shù)反映了臘腸中揮發(fā)性風(fēng)味成分對(duì)各主成分的影響程度，載荷系數(shù)絕對(duì)值越大，表明該變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)也越大。一般來(lái)說(shuō)，分布于得分圖特定部分的樣本具有載荷圖中相同位置變量的許多屬性。由圖3B可知，沿著PC1，可以觀察到僅有5 種風(fēng)味物質(zhì)（十二醇、3-羥基-2-丁酮、4-甲基-2-己酮、1-石竹烯和β-蒎烯）的載荷系數(shù)為負(fù)數(shù)。這也表明位于評(píng)分圖左側(cè)的臘腸成品及貯藏早期的樣品中這5 種風(fēng)味物質(zhì)有更高的濃度。其他32 種風(fēng)味物質(zhì)在橫軸上的載荷系數(shù)均為正數(shù)，其中己醛載荷系數(shù)最大，其次是庚醛、辛醛、 1-辛烯-3-醇、2-庚酮、戊酸、己酸、癸酸乙酯、反-2-辛烯醛、2-甲基丁醛。它們彼此接近，即高度正相關(guān)，遠(yuǎn)離中心，大多為脂肪氧化源風(fēng)味物質(zhì)。這也意味著位于評(píng)分圖右側(cè)的樣本，即貯藏后期的樣品中這幾個(gè)變量有更高的值。PC2中反,反-2,4-癸二烯醛的載荷系數(shù)最高，在PC2的風(fēng)味信息中起主要作用，可解釋風(fēng)味物質(zhì)方差信息量的12.00%；各成分中的代表性風(fēng)味物質(zhì)在評(píng)價(jià)臘腸的貨架期中有重要的作用。

圖3 PCA得分圖（A）和相關(guān)載荷圖（B）Fig. 3 PCA score plot (A) and correlation loadings plot (B)

聚類(lèi)分析可以直觀地對(duì)樣品進(jìn)行歸類(lèi)，同時(shí)熱圖將結(jié)果以一種漸進(jìn)的色帶直觀地展現(xiàn)出來(lái)，可以看出樣品中風(fēng)味物質(zhì)含量的高低程度和變化的趨勢(shì)[40]。由圖4可知，成品和貯藏35 d前的樣品被聚為第1組，而貯藏49 d和貯藏77 d的樣品被聚為第2組。圖4色帶表明：除了16（十二醇）、17（4-甲基-2-己酮）和 19（3-羥基-2-丁酮），其余大多數(shù)的風(fēng)味物質(zhì)在第1組（貯藏初期的樣品）中呈現(xiàn)藍(lán)色和白色，在第2組（貯藏后期的樣品）中大多數(shù)的風(fēng)味物質(zhì)呈現(xiàn)黃色，即含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。對(duì)于風(fēng)味物質(zhì)，3（己醛）和12 （反,反-2,4-癸二烯醛）聚為一類(lèi)，其他34 種風(fēng)味物質(zhì)聚為1 類(lèi)。因此二維聚類(lèi)熱圖分析結(jié)果與PCA結(jié)果基本一致。

圖4 二維聚類(lèi)熱圖Fig. 4 Heatmap of two-dimensional cluster analysis

3 結(jié) 論

采用P&T-TDS-GC-O-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合OAV計(jì)算對(duì)不同貯藏時(shí)間的黑白胡椒臘腸中風(fēng)味活性化合物進(jìn)行分析，得到56 種OAV不小于0.1的化合物，其中醛類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)（15 種）和OAV占比均最高，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率高達(dá)85.85%～90.35%，主要是源于脂肪氧化的直鏈醛類(lèi)；其次為醇類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、酸類(lèi)、烯烴類(lèi)以及其他雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)，共同構(gòu)成黑白胡椒臘腸的風(fēng)味。感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，黑白胡椒臘腸的顏色逐漸變暗，臘味和胡椒味逐漸降低，貯藏后期異味明顯加重，可接受度降低。結(jié)合相關(guān)性分析確定出17 種風(fēng)味活性物質(zhì)的OAV與貯藏時(shí)間呈顯著正相關(guān)，并與風(fēng)味感官評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，可作為貯藏時(shí)間和風(fēng)味惡化的最佳預(yù)測(cè)指標(biāo)。經(jīng)GC-O鑒定在貯藏末期氣味最強(qiáng)烈的化合物是己醛、反,反-2,4-癸二烯醛、庚醛、辛醛、反-2-辛烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和反-2-癸烯醛，且它們的OAV大于60，在貯藏過(guò)程中氣味強(qiáng)度增加，在產(chǎn)品中具有深度油炸味和酸敗味，可能是貯藏過(guò)程中臘腸氧化變質(zhì)后產(chǎn)生異味的主要物質(zhì)?；贠AV大于1風(fēng)味活性成分，PCA和聚類(lèi)分析可以作為一種客觀的判定和分離不同貯藏時(shí)間的黑白胡椒臘腸樣品的多元統(tǒng)計(jì)分析方法。