非靶向代謝組學對赤霞珠果皮不同砧穗組合差異代謝物的分析

章智鈞，劉懷鋒，孫軍利，趙寶龍，潘立忠，何 旺，劉晶晶

（石河子大學農學院，特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆 石河子 832003）

釀酒葡萄是經濟價值最高和種植最廣泛的水果 之一[1-2]。中國葡萄的種植面積已連續(xù)十年增長，居世界前列[3]。位于中國西北部的新疆因擁有非常適宜釀酒葡萄種植的光熱資源，釀酒葡萄產業(yè)蓬勃發(fā)展，種植面積和產量穩(wěn)居全國前列，但是新疆地域廣袤，氣候多樣，干旱、鹽堿、寒冷等生態(tài)條件嚴重限制了釀酒葡萄的進一步發(fā)展。采用嫁接技術，選用對生物脅迫（如土壤有害生物）和非生物脅迫（如寒冷、干旱及鹽堿）具有優(yōu)良耐受性的砧木，通過改變植株的水分關系、氣體交換、養(yǎng)分吸收及生長素等從而提高葡萄的抗逆性和對極端氣候的耐受性，成為釀酒葡萄發(fā)展的趨勢[4-5]。 很多研究發(fā)現適宜的砧穗組合不僅可以調控釀酒葡萄的長勢、物候期和產量，還影響釀酒葡萄的果實品質如糖、酸、單寧、花色苷、白藜蘆醇及香氣等[6-10]，甚至對葡萄酒的質量及顏色、口感等感官特性產生影響[11-13]。 但目前砧木對接穗的影響多集中在生長發(fā)育和 果實品質方面，而砧木對接穗葡萄果實中代謝物及其相關代謝過程、代謝途徑的影響還鮮見報道。

代謝組學是基于高通量、多變量數據，對生物體中的小分子代謝物成分進行分析和數據整合的研究方式，近些年發(fā)展迅速，其中非靶標代謝組學是無偏向性地分析樣品中盡可能廣泛的代謝產物，已經在生物學、臨床醫(yī)學、藥學、食品等生命科學領域廣泛應用[14]。因代謝產物最接近表型，代謝組學已經被用于食品摻假檢驗[15-16]，種植模式鑒定[17]，探索品種基因型對植物 表型[18]、環(huán)境對植物表型[19]及脅迫對植物表型的影 響[20]，研究植物不同部位代謝的差異[21]，區(qū)分植物各器官藥用價值[22]，分析貯藏條件[23]及不同原料對葡萄酒品質的影響[24]。Wang Dandan等[25]利用高效液相色譜-質譜聯用儀對黑芝麻和白芝麻進行代謝組學分析發(fā)現苯丙烷類生物合成，酪氨酸代謝和核黃素代謝途徑有差異，存在顯著差異的生物標志物與傳統(tǒng)中醫(yī)藥記錄的功能高度相關。Vanderweide等[26]采用代謝組學分析發(fā)現，早期機械去除葉片可提高葡萄花色苷及黃酮醇的含量，為提高葡萄成熟度及酚類物質提供了栽培方法。代謝組學為分析植物品種及栽培方法對植物代謝物質及其代謝通路的影響提供了方法。

本研究利用基于液相色譜- 質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯用技術的非靶向代謝組學，分析不同砧穗組合釀酒葡萄主栽品種‘赤霞珠’果皮代謝物質，經過包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）等多元統(tǒng)計分析方法，篩選不同砧穗組合葡萄代謝產物的差異并分析其相關通路，探究代謝物對葡萄品質影響，以期為葡萄砧穗組合的選擇提供理論依據，為優(yōu)質葡萄砧木的選育提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

接穗品種為釀酒葡萄‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon，簡稱：CS），品系為169，選擇抗性優(yōu)良的砧木品種分別為：冬葡萄×河岸葡萄雜交組合 （V. berlandieri×V. riparia）的品種SO4、5C，冬葡萄× 沙地葡萄雜交組合（V. berlandieri×V. rupestris）品種140R、1103P，河岸葡萄×沙地葡萄雜交組合 （V. riparia×V. rupestris）品種3309C，砧木來自于鄭州果樹研究所國家葡萄資源圃，砧穗組合為CS/1103P、 CS/SO4、CS/140R、CS/5C、CS/3309C，以CS自砧嫁接作對照。2015年秋季選取長勢一致的1 a生硬枝嫁接苗各10 株定植于新疆石河子大學農學院試驗站（86°06’N，44°32’E），株距0.5 m，栽培管理條件一致，控制各組處理產量相近。2017年秋季，在靠近根部及遠離根部各隨機采摘完全成熟葡萄果穗，在果穗中隨機選取400 g左右果粒作為一個重復，共5 個生物學重復。樣品收集后在實驗室用去離子水清洗，擦干后迅速剝皮，用錫箔紙包裝，液氮速凍，在-80 ℃超低溫冰箱中貯存。

甲醇、氯仿（均為色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純） 默克化工技術（上海）有限公司；甲酸（色譜純） 日本東京化成工業(yè)株式會社；超純水由賽多利斯新型純水系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC液相色譜儀、ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm） 美國沃特世公司；LTQ Orbitrap XL質譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；53050型真空濃縮儀、H1650-W冷凍離心機 德國艾本德公司；Arium?mini純水儀 德國Sartorius 公司；0.22 μm PTFE濾膜 天津市津騰實驗設備有限 公司；KW-100TDV型超聲波清洗器（舒美） 昆山市超聲儀器有限公司；SCIENTZ-48組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 成熟指標可溶性糖含量：采用蒽酮比色法測定；可滴定酸含量：采用酸堿滴定法測定。

1.3.2 樣品制備

稱取葡萄果皮0.500 0 g經高通量組織研磨儀研磨后取100 mg粉末于5 mL管中，加入1 000 μL甲醇 （-20 ℃），渦旋振蕩30 s；室溫超聲提取30 min，添加750 μL氯仿和800 μL ddH2O（4 ℃），渦旋振蕩1 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液1 000 μL，轉移到一個新的1.5 mL離心管中，經真空離心濃縮儀濃縮；用250 μL甲醇-水溶液（1∶1，V/V）4 ℃溶解樣品，0.22 μm膜過濾；從每個待測樣本各取20 μL混合成質量控制（quality control，QC）樣本校正混合樣品分析結果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的誤差，用剩余待測樣本進行LC-MS檢測[27]。

1.3.3 色譜條件

使 用ACQUITYUPLC?HSST3 色 譜 柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），自動進樣器溫度設為4 ℃，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進樣6 μL進行梯度洗脫，流動相A為0.1%甲酸溶液；流動相B為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，98% A、2% B；1～9.5 min，98%～50% A、2%～50% B；9.5～14 min，50%～2% A、50%～98% B；14～15 min，2% A、98% B；15～15.5 min，2%～98% A、98%～2% B；15.5～17 min，98% A、2% B。

1.3.4 質譜條件

電噴霧離子源，正負離子電離模式，正離子噴霧電壓4.80 kV，負離子噴霧電壓4.50 kV，鞘氣45 arb，輔助氣15 arb。毛細管溫度325 ℃，毛細管電壓35 V/-15 V，管透鏡電壓50 V/-50 V，以分辨率60 000進行全掃描，掃描范圍m/z50～1 000，并采用碰撞誘導裂解進行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時采用動態(tài)排除（重復計數為2）去除無必要的MS/MS信息，動態(tài)排除時間15 s[28]。

1.4 數據分析

通過Proteowizard軟件（v3.0）將數據格式轉換[29]，利用R（v3.3）進行峰識別、峰過濾、峰對齊，得到包括質荷比和保留時間及峰面積等信息的數據矩陣，再對數據進行峰面積的批次歸一化和自適換算標準化處理。使用的多元統(tǒng)計分析（軟件包SIMCA-P（v13.0）和R語言ropls包）對數據進行PCA、PLS-DA和正交-偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等化學計量學原理和多元統(tǒng)計分析。代謝組學數據由蘇州智核生物醫(yī)藥科技有限公司進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同砧穗組合‘赤霞珠’葡萄果實成熟指標

從葡萄果實完全轉色開始對葡萄成熟指標進行監(jiān)控，9月25日各處理葡萄果實中可溶性糖含量均達到200 mg/g 且相對穩(wěn)定。采樣后對葡萄中可溶性糖及可滴定酸進行測定，結果如表1所示，各組處理葡萄果實中可溶性糖及可滴定酸含量略有不同，但均無顯著性差異 （P＞0.05），各組處理葡萄果實達到相近的成熟度。

表1 不同砧木赤霞珠葡萄成熟指標Table 1 Maturity indexes of Cabernet Sauvignon in different scion-rootstock combinations

2.2 樣本分析

QC工作是進行基于質譜技術的代謝組學研究時獲得可靠且高質量的代謝組學數據的基礎。由圖1可以看出，QC樣品總離子流圖重復性好，峰分離度高，同時由圖2可發(fā)現，QC樣本相對于實驗樣本聚集，且QC誤差小于 2 倍的標準偏差以內，說明本實驗LC-MS檢測的系統(tǒng)誤差在可控范圍內。

圖1 QC樣本總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of quality control samples

圖2 QC樣本PCA得分圖Fig. 2 PCA score plots of quality control samples

2.3 不同砧穗組合‘赤霞珠’葡萄果皮代謝組差異

2.3.1 PCA

采用多維統(tǒng)計分析方法PCA對樣品進行分類，因無外加因素，得到的PCA模型反映了代謝組數據的原始狀態(tài)，有利于掌握不同砧穗組合‘赤霞珠’葡萄果皮中代謝物的整體情況并從整體上進行研究。不同砧穗組合‘赤霞珠’葡萄果皮的代謝產物PCA得分圖見圖3。 如圖3所示，CS/1103P和CS/140R兩組點分別單獨在第1象限（t[1]＞0，t[2]＞0）和第3象限（t[1]＜0，t[2]＜0），表明這兩種砧穗組合果皮中代謝物間有顯著差異，代謝模式都與其他砧穗組合代謝模式不同。CS/5C與CS/SO4兩組樣品點距離較近，CS/3309C與CS對照組兩組樣品點有部分重疊，說明CS/5C與CS/SO4、CS/3309C與CS砧穗組合果皮中代謝物間沒有顯著差異。

圖3 不同砧穗組合赤霞珠葡萄果皮PCA得分圖Fig. 3 PCA score plot of different scion-rootstock combinations

2.3.2 PLS-DA

PLS-DA可以分析高共線及噪音數據，忽略組內誤差、消除與研究目的無關的隨機誤差，是代謝組數據分類和回歸的經典工具，為進一步對不同砧穗組合對葡萄果皮代謝物分類，本研究通過PLS-DA對不同砧穗組合的代謝信息進行進一步的分析[30-31]。

不同砧穗組合葡萄果皮樣本PLS-DA得分圖和置換檢驗結果如圖4所示，其結果與PCA相似。不同砧穗組合葡萄果皮樣本的模型系數Q2為0.942、R2Y為0.995，表明模型預測能力高，模型的擬合度較好。在置換檢驗中模型Q2點從左到右均遠低于最右端的原始Q2點，且位于最右邊的R2和Q2值均超過0.9，Q2回歸線的截距為-0.479，說明模型具有較好的預測能力并且有效可用。

圖4 不同砧穗組合赤霞珠葡萄果皮PLS-DA得分圖（A）和 置換檢驗圖（B）Fig. 4 PLS-DA score (A) and permutation test plots (B) of different scion-rootstock combinations

2.3.3 OPLS-DA

OPLS-DA是代謝組學數據分析中常用的分析方法，是PLS-DA的擴展[32]。圖5為OPLS-DA得分圖，該結果與PCA結果大體一致。不同砧穗組合葡萄果皮模型參數中＝0.625，說明該模型對自變量X的解釋程度為62.5%；＝0.992，表示對分類變量Y的解釋程度為99.2%；Q2＝0.932，說明該模型對樣本變量的預測程度為93.2%，不同砧穗組合葡萄果皮代謝影響模型對自變量X的解釋程度為54.5%；對分類變量Y的解釋程度為99.5%；對樣本變量的預測程度為86.5%，結果顯示OPLS-DA模型穩(wěn)定性良好且預測能力較強。其中CS/140R和CS/5C樣本在PCA和PLS-DA中均沒有分離開，在OPLS-DA中基本分離開，表明OPLS-DA的效果更好。而CS與CS/3309C Skin樣本在PCA、PLS-DA和OPLS-DA均未分離，說明CS與CS/3309C組合在葡萄果皮中代謝模式非常相近。

圖5 不同砧穗組合赤霞珠葡萄皮OPLS-DA得分圖Fig. 5 OPLS-DA score plot of different scion-rootstock combinations

2.4 差異代謝物的篩選與鑒定

表2 不同砧穗組合葡萄果皮中顯著差異代謝物Table 2 Differential metabolites in Cabernet Sauvignon grape skins of different scion-rootstock combinations

通過OPLS-DA模型的第1主成分變量重要性值投影（variable importance in the projection，VIP）＞1且t檢驗的P≤0.05結合一維方差分析（one-way ANOVAP-value）不高于0.05，尋找差異代謝物并鑒定結果如表2所示，不同砧穗組合葡萄果皮中顯著差異代謝物有32 個。

2.5 差異代謝物熱圖分析

采用聚類分析和熱圖分析方法對不同砧穗葡萄果皮中的差異代謝產物進行分析，結果見圖6。圖中顏色表示含量，紅色表示含量高表達，綠色表示含量低表達，通過對鑒定的代謝物進行聚類分析后，從圖中條帶可以看出葡萄果皮中都有明確的高表達或者低表達的區(qū)域，可以根據表達情況區(qū)分每組處理。

圖6 不同砧穗組合葡萄果皮差異代謝物的層次聚類熱圖Fig. 6 Hierarchical clustering heatmap of metabolites of grape skins of different scion-rootstock combinations

在果皮中，CS中2-酮戊二酸、乙基阿特拉津、葡萄糖酸、L-蘇氨酸、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、L-纈氨酸、蘋果酸、異槲皮苷高于其他組合，在CS/1103P中D-焦谷氨酸、2-脫氧-α-D-吡喃核糖、兒茶素、甘油磷酸膽堿、?；撬岣哂谄渌M合，在CS/SO4中1-(3-羥基-4,5-二甲氧基苯甲酰基)己吡喃糖、γ-氨基丁酸、紫云英苷、錦葵色素-3-(6-對咖啡糖苷)、錦葵色素-3-(6-對香豆素苷)、芍藥苷-3-(6-乙酰葡萄糖苷)、矮牽牛苷-3-(6-乙酰葡萄糖苷)、二萜內酯高于其他組合，在CS/140R中沒食子酸酯、L-精氨酸、連翹苷-3-半乳糖苷、酪氨酸高于其他組合，在CS/5C中亮氨酸高于其他組合，在CS/3309C樣本中香豆酸、檸檬酸、飛燕草素-3-(6-乙酰葡萄糖苷)、賴氨酸、錦葵花素-3-葡萄糖苷高于其他組合。由此可見，不同砧木對果皮中代謝物種類和含量均有差異。

2.6 代謝產物代謝途徑分析

代謝途徑的分析是依托KEGG代謝途徑數據庫采用通路分析（MetPA）通過拓撲分析，識別出可能受不同砧穗組合影響的代謝通路[23]。圖7為不同砧穗組合葡萄果皮代謝通路影響因子圖，圖中每個圓點代表一個代謝通路，縱坐標為-lgP表示富集到通路中代謝物的顯著性，從低到高顯著性依次增加同時顏色越深。橫坐標從0～1代表差異代謝物對通路的影響值，值越大影響越大、圓圈越大。

圖7 不同砧穗組合赤霞珠葡萄果皮代謝通路影響因子圖Fig. 7 Influence of differential metabolites on metabolic pathways of Cabernet Sauvignon grape skins of different scion-rootstock combinations

如圖7和表3所示，在葡萄果皮中受不同砧穗組合擾動的代謝途徑主要是異喹啉生物堿生物合成、黃酮和黃酮醇合成、泛酸和輔酶A生物合成、檸檬酸循環(huán)等21 個通路。

表3 不同砧穗組合葡萄果皮中顯著差異代謝物Table 3 Significantly differential metabolites in grape skins of different scion-rootstock combinations

2.7 差異代謝物的分析

葡萄果實已被廣泛用于鮮食、制汁、釀酒和制藥，葡萄的代謝產物在影響葡萄生長發(fā)育的同時也是相關產品質量的重要影響因素。要保證葡萄相關產品質量安全，改良相關產品品質，對葡萄果實相關代謝產物的研究和探究對其的調控方式不可或缺。

有機酸與葡萄品質有著密切的關系，對于釀酒葡萄而言，有機酸在葡萄酒的風味構成中起重要作用，低含量的有機酸可使葡萄酒口感豐富，含量過高則會導致酸澀感增強，影響葡萄酒的口感平衡與品質[33]。2-酮戊二酸是檸檬酸循環(huán)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、賴氨酸生物合成、乙醛酸和二羧酸鹽代謝、丁酸代謝的組成部分，從圖8可以看出，在果皮中各砧穗組合相比CS均不同程度降低了2-酮戊二酸含量，嫁接后可能會降低氨基酸的合成及碳水化合物的合成。檸檬酸與蘋果酸是葡萄中重要的有機酸，本研究中CS/SO4和CS/5C砧穗組合極顯著降低了葡萄皮中檸檬酸的含量，CS/SO4、CS/140R、CS/5C和CS/3309C砧穗組合極顯著降低了葡萄果皮中蘋果酸的含量?？梢?，嫁接可以改變葡萄果皮中有機酸的含量。

圖8 不同砧穗組合葡萄果皮中差異代謝物含量箱形圖 Fig. 8 Box plots of the contents of differential metabolites in grape skins of different scion-rootstock combinations

多酚類化合物是葡萄果實中重要的次生代謝產物，保持著水果正常的生理和生化過程，調控植物生長發(fā)育，具有影響植物對生物脅迫和非生物脅迫應激保護等功能。釀酒葡萄中的多酚類化合物決定葡萄酒中顏色、口感等主要品質，并且具有抗氧化和清除自由基的作用，具有保健功能[34-35]。兒茶素、沒食子酸鹽、紫云英苷不僅具有顯著的抗氧化性，而且具有抗炎、抗過敏、修復受損DNA作用、改善心血管疾病及抗癌的功效[36-39]。本研究發(fā)現，CS/1103P砧穗組合顯著提高了葡萄果皮中兒茶素含量，CS/140R砧穗組合極顯著提高了葡萄果皮中沒食子酸鹽含量，CS/SO4、CS/140R、CS/5C和CS/3309C極顯著提高了紫云英苷含量。飛燕草素糖苷、芍藥苷、錦葵素糖苷、矮牽牛素糖苷、連翹苷等花色苷影響葡萄酒的色澤及口感，有報道發(fā)現葡萄中的花色苷具有抗癌、保護心腦血管等功效[40-42]。本研究中，CS/SO4砧穗組合不同程度提高了連翹苷-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-(6-對香豆素苷)、矮牽牛苷-3-(6-乙酰葡萄糖苷)、芍藥苷-3-(6-乙酰葡萄糖苷)、錦葵色素-3-(6-對咖啡糖苷)的含量。其他研究也有關于砧木改變接穗葡萄多酚類物質的報道[7]，及CS/M4中VviPAL3-like、VviCHS3、VviLAR2、VviUFGT花色苷合成相關基因表達量高于1103P/CS[4]，由此可以看出通過不同砧穗組合可以砧穗組合可改變葡萄果皮中多酚類物質的含量，其機制需進一步挖掘。

不同砧穗組合可以提高葡萄果皮中有機酸及多酚類物質的含量，甚至可以根據不同用途通過選擇不同砧穗組合從多方面改變葡萄果皮中成分，從而改善相關產品的口感、營養(yǎng)特性甚至是功效。

3 結 論

本研究使用LC-MS非靶向代謝組學分析方法，研究了5 種嫁接砧穗組合和CS自砧嫁接葡萄果皮中32 種差異代謝物，并對差異代謝物進行了通路富集分析，篩選出了6 種砧穗組合葡萄果皮中差異顯著的代謝途徑。發(fā)現適當的砧穗組合可以通過影響異喹啉生物堿生物合成、黃酮及黃酮醇合成、泛酸和輔酶A生物合成、檸檬酸循環(huán)等代謝途徑，改變葡萄果皮代謝物質含量。不同砧穗組合可以調節(jié)葡萄果皮中有機酸、多酚類物質的含量，提高葡萄品質，改善相關產品的口感、營養(yǎng)特性甚至是功效。

本實驗成功鑒定出了赤霞珠葡萄6 種砧穗組合的特征標志物，揭示了赤霞珠葡萄砧木對接穗影響的代謝機制，為葡萄砧穗組合的選擇提供理論依據，并為葡萄砧木的良種選育提供了方向，為改良以葡萄為原料的相關產品質量提供了重要啟示。