固有淋巴細(xì)胞在早期腸源性膿毒癥免疫抑制中的作用機(jī)制研究

楊登元，沈曉菲，陸曉峰，趙 陽(yáng)，夏雪峰，管文賢，杜峻峰

腸源性膿毒癥是普外科常見(jiàn)的重癥疾病，發(fā)病率高，預(yù)后較差，其在早期存在的免疫抑制是導(dǎo)致預(yù)后不佳的主要因素[1-2]。中性粒細(xì)胞在腸源性膿毒癥中的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，然而自身功能卻出現(xiàn)明顯改變，在膿毒癥模型中，中性粒細(xì)胞能夠上調(diào)程序性死亡配體1(programmed death ligand 1, PD-L1)的表達(dá)，抑制淋巴細(xì)胞的功能[3]；而在臨床研究中，重癥膿毒癥患者的外周血中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[4]。因此，中性粒細(xì)胞表達(dá)PD-L1是誘導(dǎo)其他免疫細(xì)胞功能抑制，推動(dòng)膿毒癥免疫抑制狀態(tài)的重要環(huán)節(jié)。然而，中性粒細(xì)胞在膿毒癥患者中上調(diào)PD-L1表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚。固有淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cells, ILCs)是最近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)免疫細(xì)胞群體，在受到外源致病菌或炎癥刺激后，可通過(guò)表面的相應(yīng)受體啟動(dòng)快速免疫應(yīng)答，因此對(duì)于早期免疫應(yīng)答起到了至關(guān)重要的調(diào)控作用[5]。雖然ILCs是組織定居細(xì)胞，但是研究人員發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)外周血中穩(wěn)定存在各亞型ILCs，提示其也能參與系統(tǒng)性免疫應(yīng)答[6]。腸源性膿毒癥患者在早期就存在復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，不同亞型的ILCs可以被不同細(xì)胞因子激活，與此同時(shí)，激活的ILCs也能通過(guò)分泌細(xì)胞因子與蛋白促進(jìn)疾病的發(fā)展。因此，ILCs可能是膿毒癥早期疾病進(jìn)程中的關(guān)鍵細(xì)胞群體。本研究利用健康志愿者及腸源性膿毒癥患者外周血，提取免疫細(xì)胞后分析ILCs的變化及其對(duì)于中性粒細(xì)胞和腸源性膿毒癥免疫抑制的潛在調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月—9月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院胃腸外科收治的7例因結(jié)腸穿孔所致腸源性膿毒癥患者，膿毒癥的診斷依據(jù)最新Sepsis-3的診斷標(biāo)準(zhǔn)：序貫器官衰竭評(píng)估評(píng)分≥2分；所有患者在入院24 h內(nèi)即進(jìn)行評(píng)分，年齡46～68歲，男3例，女4例。選取7例同期的健康志愿者，其中男4例，女3例，年齡38～72歲，既往無(wú)嚴(yán)重心、肝、腎、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)疾病，無(wú)放化療及免疫調(diào)節(jié)藥物或激素服用史。健康志愿者與腸源性膿毒癥患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。無(wú)論是患者還是志愿者都簽署知情同意書(shū)。

1.2外周血處理 獲取健康志愿者及腸源性膿毒癥患者外周血10 ml，加入Ficoll分離液，按照外周血∶PBS∶Ficoll分離液4∶4 ∶6的比例進(jìn)行離心，室溫，30 min，上升速度最大，下降速度最低；離心后獲取薄霧狀中間層細(xì)胞，進(jìn)行洗滌。

1.3流式細(xì)胞術(shù)及體外刺激共培養(yǎng) 人類(lèi)外周血ILC2(2型固有淋巴細(xì)胞)：CD45+Lineage-IL-7Rα+CRTH2+；分選后的細(xì)胞利用20%細(xì)胞培養(yǎng)基在體外使用人白介素-12(interleukin-12, IL-12)及IL-33刺激，濃度均為50 ng/ml，刺激3 d后分別獲取細(xì)胞和上清液以備檢測(cè)，細(xì)胞利用BD公司FACS CantoⅡ檢測(cè)，上清液應(yīng)用R&D公司生產(chǎn)的γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；在部分實(shí)驗(yàn)中，加入流式細(xì)胞術(shù)分選的中性粒細(xì)胞，再培養(yǎng)12 h后檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1腸源性膿毒癥患者外周血ILCs亞群的變化 無(wú)論是健康志愿者還是腸源性膿毒癥患者，外周血內(nèi)均存在3型ILCs：ILC1、ILC2和ILC3。見(jiàn)圖1A。與健康志愿者比較，腸源性膿毒癥患者外周血ILC1比例顯著上升，而ILC2的比例則顯著下調(diào)(P<0.05)，ILC3的比例則變化不顯著(P>0.05)。見(jiàn)圖1B和表1。提示在腸源性膿毒癥早期，ILCs的亞群就存在顯著變化，可能對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展起到推動(dòng)作用。

表1 健康志愿者及腸源性膿毒癥患者外周血ILCs亞群比較

2.2腸源性膿毒癥患者外周血中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)情況 分析健康志愿者與腸源性膿毒癥患者外周血中性粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，健康志愿者外周血中性粒細(xì)胞幾乎不表達(dá)PD-L1，然而在腸源性膿毒癥患者體內(nèi)，中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)顯著上調(diào)。見(jiàn)圖2A。在過(guò)去研究中，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞是表達(dá)PD-L1的主要固有免疫細(xì)胞群體，然而在腸源性膿毒癥早期，中性粒細(xì)胞是表達(dá)PD-L1最顯著的細(xì)胞群體(P<0.05)。見(jiàn)圖2B。提示PD-L1對(duì)后續(xù)免疫抑制的發(fā)生起到重要推動(dòng)作用。

圖2 健康志愿者及腸源性膿毒癥患者外周血中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)情況

2.3腸源性膿毒癥患者中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平與ILC1比例的相關(guān)性 為了探索ILC2與ILC1比例的變化，尤其是ILC1比例的顯著上調(diào)是否對(duì)腸源性膿毒癥免疫抑制產(chǎn)生影響，本研究對(duì)中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平與ILC1比例進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平與ILC1比例呈正相關(guān)(R2=0.5959)。見(jiàn)圖3。提示ILCs可能參與中性粒細(xì)胞在腸源性膿毒癥早期上調(diào)PD-L1的表達(dá)。

2.4體外IL-33和(或)IL-12刺激ILC2可以轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1 為了探索ILC1比例增加的原因，及其是否能直接作用于中性粒細(xì)胞，促進(jìn)PD-L1的表達(dá)并導(dǎo)致膿毒癥免疫抑制，本研究首先運(yùn)用體外實(shí)驗(yàn)，探索ILC2是否能被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1，將獲取的外周血ILC2在體外分別運(yùn)用IL-33、IL-12及IL-12+IL-33刺激，發(fā)現(xiàn)在體外IL-12或IL-12+IL-33刺激下，ILC2確實(shí)能夠轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1，ILC1特征性轉(zhuǎn)錄因子T-bet高表達(dá)(P<0.05)，上清液亦可檢測(cè)到高水平的IFN-γ(P<0.05)。當(dāng)將中性粒細(xì)胞與由ILC2轉(zhuǎn)變而來(lái)的ILC1共培養(yǎng)后，中性粒細(xì)胞PD-L1的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。提示腸源性膿毒癥早期，ILC2能轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1，促進(jìn)中性粒細(xì)胞表達(dá)PD-L1，推動(dòng)腸源性膿毒癥免疫抑制的產(chǎn)生。

3 討論

深入闡明腸源性膿毒癥的病理生理過(guò)程是治療疾病，改善預(yù)后的前提。目前學(xué)者們一致認(rèn)為，腸源性膿毒癥是病原菌與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互較量的過(guò)程；機(jī)體在抗菌的同時(shí)啟動(dòng)促炎反應(yīng)，作為一種代償機(jī)制，機(jī)體內(nèi)同時(shí)或相繼出現(xiàn)抗炎反應(yīng)：效應(yīng)性T細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、中性粒細(xì)胞功能失調(diào)、內(nèi)毒素重新整合、MHC-2類(lèi)分子在抗原提呈細(xì)胞表面表達(dá)下調(diào)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及髓系抑制性細(xì)胞比例上調(diào)等。因此部分學(xué)者認(rèn)為增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、逆轉(zhuǎn)腸源性膿毒癥早期即存在的免疫抑制才是新的治療方向[2]。ILCs作為最近新發(fā)現(xiàn)的免疫細(xì)胞群體，數(shù)量雖少，但是因其在炎癥與感染早期能夠被快速激活，成為現(xiàn)今免疫細(xì)胞群體的關(guān)注焦點(diǎn)；然而其在腸源性膿毒癥中扮演的角色尚未闡明。本研究初步證實(shí)，在腸源性膿毒癥早期，ILCs各亞群就存在變化，ILC1的比例顯著上調(diào)，而ILC2的比例則顯著下調(diào)，進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)表明，ILC1比例的上調(diào)可能與ILC2/ILC1轉(zhuǎn)化有關(guān)；本研究還發(fā)現(xiàn)，腸源性膿毒癥患者外周血中性粒細(xì)胞在早期就顯著上調(diào)PD-L1的表達(dá)，并且其表達(dá)水平與ILC1的比例呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)；進(jìn)一步的體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ILC2轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1后，確實(shí)能顯著上調(diào)腸源性膿毒癥患者外周血中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)。因此上述結(jié)果提示，ILCs在腸源性膿毒癥早期就存在ILC2/ILC1轉(zhuǎn)化，促進(jìn)中性粒細(xì)胞表達(dá)PD-L1，從而推動(dòng)免疫抑制的產(chǎn)生。

圖3 腸源性膿毒癥患者中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平與ILC1比例的相關(guān)性

圖4 體外IL-33和(或)IL-12刺激ILC2后T-bet、IFN-γ以及中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)情況

中性粒細(xì)胞作為體內(nèi)數(shù)量最多的免疫細(xì)胞群體，在膿毒癥中的作用一直是研究的熱點(diǎn)。由于中性粒細(xì)胞的生存期限與其他免疫細(xì)胞尤其是記憶性細(xì)胞相比，相對(duì)短暫，因此過(guò)去認(rèn)為中性粒細(xì)胞主要是終末效應(yīng)性細(xì)胞，對(duì)于其他細(xì)胞的調(diào)控作用甚微。然而最近的研究表明，在炎癥狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞在外周循環(huán)及感染灶都能與獲得性免疫細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞)相互聯(lián)系，并且對(duì)T淋巴細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)控。中性粒細(xì)胞能通過(guò)分泌活性氧和精氨酸-1對(duì)淋巴細(xì)胞的功能起到負(fù)調(diào)控作用[7]。PD-L1作為下調(diào)淋巴細(xì)胞免疫功能的重要抑制性分子，是表達(dá)于T淋巴細(xì)胞表面PD-1的配體，一旦與PD-1結(jié)合能啟動(dòng)T淋巴細(xì)胞凋亡與功能抑制。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)哮喘患者痰液中性粒細(xì)胞及HIV感染患者外周血中性粒細(xì)胞能高表達(dá)PD-L1，并對(duì)淋巴細(xì)胞功能起到抑制作用[8-9]；而在膿毒癥中，無(wú)論是動(dòng)物模型還是人類(lèi)試驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)，中性粒細(xì)胞在早期就能通過(guò)表達(dá)PD-L1誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)免疫抑制的產(chǎn)生，然而調(diào)控腸源性膿毒癥早期中性粒細(xì)胞上調(diào)PD-L1的細(xì)胞學(xué)機(jī)制尚未揭示。本研究結(jié)果則初步證實(shí)，ILCs是腸源性膿毒癥早期誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞上調(diào)PD-L1表達(dá)的主要細(xì)胞群體。

ILCs對(duì)于中性粒細(xì)胞的調(diào)控主要集中在ILC3，其通過(guò)分泌粒細(xì)胞集落刺激因子和IL-17A，對(duì)中性粒細(xì)胞在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10]；而在重癥哮喘這一炎癥疾病狀態(tài)下，ILC2可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗L-17A的炎性ILC3，促進(jìn)中性粒細(xì)胞在重癥哮喘狀態(tài)下肺部的浸潤(rùn)，促進(jìn)哮喘的急性發(fā)作[11]。ILCs是否能通過(guò)其他調(diào)控機(jī)制介導(dǎo)與中性粒細(xì)胞間的相互作用尚不明確，基于ILCs和中性粒細(xì)胞均是機(jī)體抵御外界病原菌侵入的首道防線(xiàn)，探索二者在炎癥狀態(tài)下，例如膿毒癥模型中的相互作用，或許是新的思路。另外，不同亞型ILCs在依靠分泌多種細(xì)胞因子和蛋白發(fā)揮作用的同時(shí)，也能相互轉(zhuǎn)化[12]。這種轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是機(jī)體免疫系統(tǒng)為了適應(yīng)外界刺激而產(chǎn)生積極有效的免疫應(yīng)答，例如在腸道損傷與感染中，腸道ILC3也可以轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1，促進(jìn)免疫應(yīng)答的發(fā)展[5]；然而這種ILCs間的轉(zhuǎn)化如無(wú)法得到逆轉(zhuǎn)，也會(huì)出現(xiàn)有害的一面，例如在慢性阻塞性肺疾病中，ILC2可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗FN-γ的ILC1，加重呼吸道損傷[13]。在克羅恩病患者的腸道組織中，發(fā)現(xiàn)存在分泌IL-13及IFN-γ的ILCs，并且其數(shù)量及比例與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[14]。本研究則發(fā)現(xiàn)，在腸源性膿毒癥早期，ILC2可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗FN-γ的ILC1，推動(dòng)腸源性膿毒癥免疫抑制的產(chǎn)生。這一結(jié)果，為ILCs在疾病狀態(tài)下的相互轉(zhuǎn)化理論做出了有效擴(kuò)充，下一步深入探索調(diào)控ILCs間相互轉(zhuǎn)化的內(nèi)在分子機(jī)制，將為早期阻斷腸源性膿毒癥免疫抑制的產(chǎn)生，改善患者的預(yù)后提供新的方向。