甘草甜素對糖尿病視網(wǎng)膜病變的神經(jīng)保護作用

蔣曉梅，劉 翀

（麗水市中心醫(yī)院藥學部，麗水323000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是一種與糖尿病相關(guān)的神經(jīng)退行性并發(fā)癥，是成年人早期視力下降甚至致盲的主要原因［1］。DR 具有復雜的多因素病理生理學，由高血糖誘導的神經(jīng)變性視網(wǎng)膜病變具有致盲的威脅［1-2］。DR 的治療方式主要包括玻璃體內(nèi)注射抗血管生成藥物以及手術(shù)干預。

甘草甜素（glycyrrhizin，GL）是一種天然的抗炎和抗真菌因子。它通過抑制高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病起到保護作用［3］。使用大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的研究表明，GL 具有神經(jīng)保護作用［4］。以往研究證明GL 對HMGB1 的抑制可以保護視網(wǎng)膜免受I/R 損傷［5］。然而，GL 在糖尿病中對視網(wǎng)膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)的作用尚不清楚。本研究探討GL 作為神經(jīng)膠質(zhì)活性和突觸可塑性調(diào)節(jié)劑對視網(wǎng)膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)的保護作用。

1 材 料

1.1 試 劑

甘草甜素（glycyrrhizin，GL）及鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma Aldrich 公司）；One Touch Horizon 血糖儀［強生（中國）醫(yī)療器材有限公司］；磷酸鹽緩沖液（PBS）、一抗GFAP、第一鏈cDNA 合成試劑盒（美國賽默飛世爾公司）；GAP43和GLUT-1（英國Abcam），生物素標記的二抗、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（P0202）、TRIzol 試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀 器

OneTouch Ultra 自動血糖儀（強生醫(yī)療器械有限公司）；Olympus CX21光學顯微鏡（日本Olympus公司）；ABI 7500 實時PCR 系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 動 物

C57BL/6 小鼠21 只，雄性，體重（26 ± 3）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物質(zhì)量合格證許可證號：SCXK（京）2016-0006，于溫度（24 ± 4）℃，光照周期正常，食物和水連續(xù)供應的環(huán)境中自適應飼養(yǎng)1 周。所有動物實驗均經(jīng)動物倫理委員會批準。

2 方 法

2.1 動物分組及糖尿病小鼠實驗模型建立

小鼠隨機分為對照組（Control）、模型組（Model）及甘草甜素（GL）組，每組7 只。對照組小鼠注射生理鹽水，模型組及GL組用STZ（60 mg/kg）單劑量腹腔注射，72 h 后取小鼠尾靜脈血，用自動血糖儀檢測血糖不低于16.7 mmol/L，證實建模成功。建模成功后GL 組灌胃給予GL（150 mg/kg/d），持續(xù)5 周。對照組及模型組用等劑量的生理鹽水灌胃。實驗結(jié)束時，斷頭法處死小鼠，取眼球并解剖得到視網(wǎng)膜組織進行組織病理學研究、免疫組化和RT-PCR檢測。

2.2 組織病理學檢查

視網(wǎng)膜組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，用于組織病理學檢查。5 μm 厚度切片進行脫蠟，逐級酒精脫水，伊紅染色。觀察切片形態(tài)學變化。采用光學顯微鏡400×透鏡進行視網(wǎng)膜總厚度、外核層（outer nuclear layer，ONL）厚度、內(nèi)核層（inner nuclear layer，INL）厚度測量和神經(jīng)節(jié)細胞層細胞計數(shù)（ganglion cell layer，GCL）等形態(tài)學分析［6］。每只小鼠每個視網(wǎng)膜至少有3個切片。

2.3 免疫組化染色及評價

將福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片（4 μm）安裝在帶正電荷的載玻片上，進行免疫組化染色。視網(wǎng)膜切片用3% H2O2孵育10 min，PBS沖洗5 min，用一抗GFAP（1∶100）、GAP43（1∶500）和GLUT1（1∶250）孵育，4 ℃過夜。PBS 沖洗，生物素標記的二抗室溫孵育30 min，DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒染色，再用蘇木精進行復染。光學顯微鏡觀察星形細胞突起和視網(wǎng)膜層上GFAP 和GAP43的表達。GLUT-1染色強度根據(jù)不同視網(wǎng)膜層的相對染色強度，對視網(wǎng)膜切片進行半定量評分（0 ～3+）［7］。圖像處理用Image pro plus 6.0 軟件進行。

2.4 實時RT-PCR檢測

根據(jù)制造商的說明，使用TRIzol 試劑從冷凍組織中提取總RNA。使用第一鏈cDNA 合成試劑盒將RNA 轉(zhuǎn)化為cDNA。使用實時PCR 系統(tǒng)進行實時PCR。引物序列詳見表1。使用2-ΔΔCT數(shù)據(jù)進行分析，并與內(nèi)參GAPDH進行比較。

2.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 軟件進行統(tǒng)計檢驗，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行評估，然后采用Bonferroni的事后分析進行比較。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)或PCR 結(jié)果的定量數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，通過非參數(shù)方差分析和事后檢驗進行分析。P＜0.05表明差異顯著。

Table 1 Primer sequences for real-time RT-PCR detection

3 結(jié) 果

3.1 GL對糖尿病視網(wǎng)膜的組織病理學影響

如圖1-A 所示，對照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常，與對照組相比，模型組視網(wǎng)膜出現(xiàn)明顯的形態(tài)學改變，如視網(wǎng)膜層組織明顯紊亂、血管生成及神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目減少等（圖1-B），而GL 組視網(wǎng)膜形態(tài)學相對于模型組輕微改善（圖1-C）。與對照組相比，模型組視網(wǎng)膜總厚度、INL 厚度、ONL 厚度存在差異，GL 組與模型組相比視網(wǎng)膜總厚度有顯著性差異，但INL、ONL 厚度差異不顯著（圖1-D）。與對照組相比，模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞有所下降，但GL治療后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞增多（圖1-E，P＜0.05）。

Figure 1 Histopathological effects of glycyrrhizin (GL) on diabetic retina (400×)A:Control;B:Model;C:GL group;D:Total retinal thickness,INL thickness,ONL thickness,E:Number of retinal ganglion cells (xˉ± s, n = 7)ONL:Outer nuclear layer;INL:Inner nuclear layer;GCL:Ganglion cell layer;GL:Glycyrrhizin*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group

3.2 GL對糖尿病視網(wǎng)膜中GLUT1的影響

GLUT1染色切片的免疫組化圖像如圖2所示。對照組小鼠的視網(wǎng)膜表現(xiàn)出GLUT1表達的多細胞定位，尤其是在NFL、GCL 和ONL 中。而模型組上述視網(wǎng)膜層GLUT1表達較強，GL治療后GLUT1的表達在定位和強度上均與正常組相當（圖2-D，P＜0.05）。

3.3 GL對糖尿病視網(wǎng)膜中GAP43的影響

圖3 為GAP43 染色的視網(wǎng)膜切片，它明顯存在于GCL、INL和IPL中。與對照組的視網(wǎng)膜相比，模型組視網(wǎng)膜GCL 和IPL 的GAP43 免疫染色明顯減少。然而，與糖尿病小鼠相比，GL治療的糖尿病小鼠GCL 和IPL 的GAP43 染色均顯著增加（圖3-D，P ＜0.05）。

Figure 2 Immunohistochemical staining of GLUT1 in mouse retinasA:Control;B:Model;C:GL group;D:GLUT-1 staining intensity score (xˉ± s, n = 7)* P＜0.05 vs control group;# P＜0.05 vs model group

Figure 3 Immunohistochemical staining of GAP43 in mouse retinasA:Control;B:Model ;C:GL group;D:GAP43 staining intensity (xˉ± s, n = 7)*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group

3.4 GL對糖尿病視網(wǎng)膜中GFAP的影響

GFAP免疫染色見圖4。在對照組視網(wǎng)膜NFL/GCL 中，GFAP 的表達可以忽略不計。模型組視網(wǎng)膜GFAP 表達明顯增加，主要表現(xiàn)在NFL/GCL、IPL和橫跨整個神經(jīng)視網(wǎng)膜的繆勒氏細胞中。相比之下，使用GL 治療6 周的小鼠免疫染色面積明顯下降（圖4-D，P ＜0.05）。

3.5 GL 對糖尿病視網(wǎng)膜炎癥和凋亡介質(zhì)的表達的影響

在糖尿病動物模型中，視網(wǎng)膜組織中出現(xiàn)炎癥、氧化和增殖標志物的異常表達，見圖5，與對照組相比，模型組小鼠TNF-α、IL6、NF-κB、iNOS 和Tp53 的mRNA 表達增加。而在用GL 治療的糖尿病小鼠中，上述基因的相對表達水平明顯降低。模型組的數(shù)據(jù)具有高度的變異性和分布性，故需要非參數(shù)統(tǒng)計分析，并使用箱形圖表示。

Figure 5 mRNA expression of inflammatory and apoptotic mediators in mouse retinas (xˉ± s, n = 7)A:TNF-α;B:IL-6;C:NF-κB;D:iNOS;E:Tp53*P＜0.05 vs control group;# P＜0.05 vs model group

4 討 論

DR 是一種進展緩慢的疾病，出現(xiàn)臨床癥狀需要數(shù)年時間［1］。維持良好的血糖水平、血脂和血壓有助于降低發(fā)病率和阻礙DR 發(fā)展［1，8］。然而，現(xiàn)有的治療方法有限，據(jù)報道，用胰島素或口服降糖藥改善血糖控制可抑制DR 的早期階段，但對許多糖尿病患者來說，血糖控制仍然難以實現(xiàn)［8］。

高血糖誘導的氧化應激和炎癥反應是DR 發(fā)病的主要原因［9-10］。視網(wǎng)膜的神經(jīng)和血管維持著視網(wǎng)膜的健康和完整功能。在糖尿病中，葡萄糖通過代謝途徑（終末糖基化產(chǎn)物堆積）進入視網(wǎng)膜組織導致氧化應激［9］。在病理特征中，膠質(zhì)細胞活化導致促炎性細胞因子和炎性細胞因子的表達［10-11］。本研究顯示糖尿病模型小鼠視網(wǎng)膜層受損和衰弱、NFL 增厚、GCL 退行性改變、ILM 內(nèi)血管生成和微動脈瘤形成，與之前關(guān)于糖尿病大鼠的研究相一致［6］。此外，本研究中促進DR 發(fā)病的GLUT1 在糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜中上調(diào)，據(jù)報道，抑制GLUT1 是一種潛在治療DR 的策略［12］。GLUT是一種轉(zhuǎn)運蛋白家族，用于轉(zhuǎn)運葡萄糖，抑制GLUT1 的表達限制葡萄糖的運輸，從而降低了視網(wǎng)膜的葡萄糖濃度并改善了糖尿病性視網(wǎng)膜病變［12-13］。本研究數(shù)據(jù)提示GL 治療后改善了與糖尿病相關(guān)的視網(wǎng)膜和血管損傷，且降低了GLUT 表達，這一發(fā)現(xiàn)可能表現(xiàn)了甘草甜素在視網(wǎng)膜血糖水平中的作用，使得視網(wǎng)膜幾乎處于正常血糖水平，但仍需要進一步研究GL 對視網(wǎng)膜組織的葡糖糖含量的影響或GL 對體外的視網(wǎng)膜組織在高糖刺激下的葡糖糖吸收的影響。

此外，GL 還下調(diào)了糖尿病小鼠中神經(jīng)元應激指標和膠質(zhì)細胞活化標志物GFAP，而上調(diào)了神經(jīng)元再生標記物GAP43。GAP43 定位于軸突生長錐，參與神經(jīng)系統(tǒng)突觸的可塑性，在糖尿病大鼠中GAP43下調(diào)［14］，而GFAP 下調(diào)被認為是一種保護機制［15］。本研究還提示使用GL 治療DR 可以改善炎癥狀態(tài)，改善細胞因子水平。GL 主要通過減少炎性細胞因子TNF-α 和IL-1β 的表達，從而體現(xiàn)抗炎活性［16］。陳繼紅［17］報道稱，GL 的抗炎活性是通過抑制HMGB1/TLR-4/NF-kB途徑。同時，在GL治療的小鼠中凋亡標志物Tp53 和iNOS 的表達也下調(diào)。這一變化在不同視網(wǎng)膜層的增強和再生組織病理學檢查中，尤其是GCL 和INL 中，得到了明顯的反映。Tp53是一種在視網(wǎng)膜細胞中誘導的抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子，它能在組織碎片的免疫介導清除下保護膠質(zhì)細胞不被清除［15，18］。在以前的研究中，GL 具有神經(jīng)保護作用，這在糖尿病神經(jīng)病變中得到了證實和報道［16-17］。

綜上所述，本試驗研究結(jié)果顯示，在DR 的實驗模型中，甘草甜素主要發(fā)揮其抗炎和神經(jīng)保護作用，提示GL 在DR 的病例中可能具有良好的應用前景。