新型豬瘟耐熱活疫苗凍干工藝設(shè)計(jì)分析

么 亮

（華威特（江蘇）生物制藥有限公司，江蘇泰州 225300）

0 引言

豬瘟是一種由CSFV病毒引發(fā)的高度接觸性傳染病，被我國(guó)列為一類動(dòng)物疫病，對(duì)于養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。當(dāng)前市場(chǎng)現(xiàn)有豬瘟活疫苗對(duì)于冷鏈環(huán)境、保護(hù)劑及干燥工藝的要求較高，且耐熱性能較差、存在一定副作用、無(wú)法實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)，對(duì)于活疫苗工藝規(guī)律的改進(jìn)與優(yōu)化提出了現(xiàn)實(shí)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料選取TB公司生產(chǎn)的豬瘟兔化弱毒株與ST細(xì)胞，日齡為90～110d的健康種兔，20日齡仔豬，J研究所研發(fā)的豬瘟耐熱配方，以及S公司生產(chǎn)的dmem培養(yǎng)基、C5H8NNaO4等試劑。試驗(yàn)儀器選用0.15㎡、0.5㎡和2㎡三種規(guī)格的冷凍真空干燥機(jī)，恒溫干燥箱（溫度分別為37℃和45℃），熒光顯微鏡，F(xiàn)DCS196低溫凍干顯微鏡，以及DSC熱分析儀。

1.2 試驗(yàn)參數(shù)測(cè)定

選用DSC熱分析儀針對(duì)毒株與豬瘟耐熱配方混合溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得混合液升溫速率為10℃/min，由初始溫度上升至30℃，溫差為80℃。選用FDCS196低溫凍干顯微鏡進(jìn)行混合液測(cè)定，測(cè)得初始溫度、最終溫度分別為18℃和-45℃，降溫速率達(dá)到每秒0.3℃，真空度為20Pa。

1.3 凍干程序

在凍干程序設(shè)計(jì)上分為三個(gè)環(huán)節(jié)：在預(yù)凍環(huán)節(jié)，將隔板溫度設(shè)為4℃、-42℃、-42℃，對(duì)應(yīng)的時(shí)間分別為60min、120min、150min，預(yù)凍方式均為H，真空度不計(jì)；在一次干燥環(huán)節(jié)，將隔板溫度分別設(shè)為-10℃、4℃和20℃，在R條件下對(duì)應(yīng)的時(shí)間分別為30min、30min和120min，與H對(duì)應(yīng)的時(shí)間分別為600min、200min和150min，真空度均為100Pa；在二次干燥環(huán)節(jié)，將隔板溫度設(shè)為28℃，與H對(duì)應(yīng)的時(shí)間為200min，真空度不計(jì)。其中H為快速降溫/升溫至預(yù)設(shè)溫度后維持一段時(shí)間；R為設(shè)定時(shí)間內(nèi)慢速降溫/升溫至預(yù)設(shè)溫度[1]。取凍形合格、殘水率≤3%的樣品，置于37℃環(huán)境下保存10d，完成耐老化試驗(yàn)和間接免疫熒光法檢測(cè)，確保病毒滴度下降之差≯1Lg，并基于RID方法完成復(fù)核。在此基礎(chǔ)上，選用0.15㎡、0.5㎡和2㎡三種規(guī)格的凍干機(jī)進(jìn)行逐級(jí)放大，完成工藝放大處理。

1.4 疫苗性能檢測(cè)

選取耐熱性、安全性兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行活疫苗性能檢測(cè)，選取活疫苗依據(jù)三個(gè)批次置于37℃、45℃兩種溫度環(huán)境下進(jìn)行保存，測(cè)定疫苗的TCID50/ml指標(biāo)，并將其與商品苗進(jìn)行比較，判斷耐熱效果；同時(shí)選用生理鹽水分別配制出10頭份/ml、20頭份/ml、30頭份/ml的疫苗，以1ml/頭的劑量對(duì)10頭仔豬進(jìn)行肌肉注射，并配置未注射疫苗的對(duì)照組，結(jié)合免疫后仔豬的臨床表現(xiàn)判斷疫苗的安全性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)參數(shù)測(cè)定結(jié)果

通過觀察豬瘟耐熱配方混合液的測(cè)定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，混合液的共晶點(diǎn)為-26.5℃，塌陷溫度為-22.5～-20.5℃。將其與凍干工藝相結(jié)合，預(yù)凍溫度約為16.5～18.5℃，低于混合液共晶點(diǎn)，可保障樣品的凍實(shí)度；在一次干燥階段，工藝溫度未超過混合液的塌陷溫度，可保障樣品的多孔結(jié)構(gòu)與效價(jià)。

2.2 凍干程序建立

結(jié)合豬瘟耐熱配方混合液的熱參數(shù)性能，將預(yù)凍階段的隔板溫度取值為-42℃，一次干燥階段的隔板溫度設(shè)為-20℃、-15℃、-10℃和0℃，通過觀察樣品的凍干形態(tài)可見，在一次干燥階段隔板溫度為0℃時(shí)，樣品底部出現(xiàn)明顯收縮現(xiàn)象、凍干形態(tài)較差。而依照預(yù)先設(shè)定的凍干程序進(jìn)行疫苗耐熱性能測(cè)試可知，其耐熱損失僅為0.51Lg，殘水率<3%，且復(fù)核結(jié)果顯示耐熱損失為0.46Lg。在現(xiàn)有0.15㎡凍干機(jī)的基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝放大，分別選取3個(gè)批次樣品進(jìn)行測(cè)試與記錄，可觀察到在0.5㎡凍干機(jī)上的三個(gè)樣品批次的凍干損失分別為0.17±0.09、0.19±0.04、0.35±0.03，耐熱損失分別為0.9±0.08、0.78±0.1、0.9±0.03，凍干損失均<0.4Lg、耐熱損失均<1.0Lg，符合要求、實(shí)現(xiàn)可重復(fù)性；而2㎡凍干機(jī)上樣品的耐熱損失為1.8±0.12，殘水率為3%±0.17%，需通過降低一次干燥階段的隔板溫度、增加干燥時(shí)間，方可保障獲得良好的凍干效果、實(shí)現(xiàn)可重復(fù)性。此外，需注重控制好凍干規(guī)模在2㎡條件下的凍干程序與工藝，降低一次干燥階段的隔板溫度、延長(zhǎng)凍干時(shí)間。

2.3 疫苗性能分析

2.3.1 耐熱性能

疫苗在37℃條件下可保存20d左右，耐熱損失接近1.0Lg；在45℃條件下可保存14d左右，耐熱損失為1.0Lg。樣品在兩種溫度條件下的耐熱損失均小于商品苗，證明其具備良好的耐熱性能。

2.3.2 安全性能

針對(duì)10頭20日齡仔豬分別注射10頭份、20頭份、30頭份疫苗，觀察仔豬均未發(fā)生不良反應(yīng)，精神狀態(tài)、進(jìn)食量、體溫等指標(biāo)與對(duì)照組基本保持一致，由此說明本文選用的豬瘟耐熱配方安全性能達(dá)標(biāo)，具備實(shí)際推廣價(jià)值。

3 結(jié)論

現(xiàn)階段我國(guó)研發(fā)出的豬瘟活疫苗在37℃溫度環(huán)境下最高可保存10d左右，疫苗的耐熱性仍有待提升。本文結(jié)合凍干程序與耐熱損失等指標(biāo)探索出一種放大工藝，可在0.5㎡凍干規(guī)模下維持豬瘟活疫苗的耐熱性與安全性，有效實(shí)現(xiàn)工藝優(yōu)化、提升活疫苗的耐熱效果，為活疫苗的批量化生產(chǎn)及工藝推廣提供借鑒價(jià)值。