間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性胰腺炎機制的研究進(jìn)展

孫曉莉，金世柱

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150000

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種高死亡率的胰腺無菌性炎癥，是臨床中常見急性腹痛癥之一[1]。據(jù)統(tǒng)計[2]，AP的全球年發(fā)病率約33.74/10萬人，且呈逐年增長的趨勢。其中90%～95%的患者為輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis,MAP)或中-度重癥胰腺炎，病情較輕、預(yù)后較好。其中5%～10%患者可進(jìn)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)，除了危重的臨床表現(xiàn)外，通常合并嚴(yán)重的并發(fā)癥，如休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征及多器官功能衰竭，病死率為25%～50%，嚴(yán)重危及患者生命。迄今為止，對于AP的治療，僅局限于常規(guī)的補液、對癥支持、營養(yǎng)支持、預(yù)防胰腺感染、壞死、手術(shù)等，仍無合適的治療方案。AP的治療一直是臨床與基礎(chǔ)的研究重點，根據(jù)目前的研究進(jìn)展[3]，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因多種特殊的生物學(xué)特性被認(rèn)為是治療AP的一種很有前途的手段。在本文中，我們對目前已發(fā)現(xiàn)的MSCs治療AP的相關(guān)機制作一概述。

MSCs是一種來源廣泛的(如骨髓、脂肪組織、胎盤和臍帶組織等)多能干細(xì)胞[4]，同時具有強大的自我更新及多項分化的潛能。MSCs無人類主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ抗原，避免了免疫排斥反應(yīng)，這使得MSCs在組織工程學(xué)中得以廣泛應(yīng)用。鑒于其多向分化的能力，MSCs已被廣泛地應(yīng)用于永久性細(xì)胞的替代治療[5-6]。同時MSCs具有免疫抑制功能，可通過調(diào)控炎癥微環(huán)境進(jìn)而發(fā)揮獨特的免疫調(diào)節(jié)潛能。近年來，MSCs治療已經(jīng)在多種疾病的臨床試驗[7]及多種消化系疾病的動物模型中成功開展，如肝硬化[8]、肝衰竭[9]、結(jié)腸炎[10]等。

1 MSCs的定義

20世紀(jì)50年代，MSCs被Friedenstein等在大鼠骨髓抽取物中發(fā)現(xiàn)并成功分離培養(yǎng)。國際細(xì)胞治療協(xié)會提出了以下幾點MSCs定義標(biāo)準(zhǔn)[11]：(1)不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD45、CD34、CD33、CD14、CD117；(2)體外可誘導(dǎo)成骨、軟骨及脂肪細(xì)胞；(3)體外培養(yǎng)時具有成纖維樣貼壁生長的細(xì)胞形態(tài)。

2 MSCs的生物學(xué)特性

2.1 多向分化的潛能及去分化的功能MSCs在體內(nèi)及體外可分化為神經(jīng)祖細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝樣細(xì)胞、成骨細(xì)胞、髓核樣細(xì)胞等。Zhang等[12]證明了HGF過表達(dá)的大鼠牙髓MSCs移植入大鼠體內(nèi)后可定植并分化為肝樣細(xì)胞。Han等[13]發(fā)現(xiàn)，體外在模擬微重力條件下轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的誘導(dǎo)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可分化成為髓核樣細(xì)胞。Zhang等[14]使用大鼠牙髓MSCs移植治療大鼠放射食管炎，證明移植的牙髓MSCs可在損傷的食管黏膜處定植分化，并發(fā)現(xiàn)大鼠移植MSCs后食管黏膜細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)均明顯減輕。

MSCs不僅具有多項分化的潛能，已分化的MSCs還具有回復(fù)為原始MSCs的能力，即去分化能力。在改變分化后MSCs的培養(yǎng)條件后，已分化的MSCs能夠回復(fù)到未分化時的原始MSCs，并可再次誘導(dǎo)分化為其他類型的細(xì)胞[15]，且與未分化的MSCs相比，抗凋亡相關(guān)基因表達(dá)增多、生存期延長。

2.2 低免疫原性MSCs是一種免疫缺陷細(xì)胞，具有低免疫原性，可以用于不同個體間的移植。效應(yīng)T細(xì)胞的活化依賴于MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子，因此，當(dāng)MSCs在活化效應(yīng)T細(xì)胞時，由于MSCs缺乏MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子，T細(xì)胞對異種抗原的識別受阻，難以產(chǎn)生有效的排異反應(yīng)，從而提高M(jìn)SCs移植的存活率。

2.3 歸巢特性歸巢通常指MSCs向靶組織、靶器官定向趨化，穿過毛細(xì)血管壁至靶組織、靶器官并定植分化為特異性組織細(xì)胞的過程，是干細(xì)胞治療的初始環(huán)節(jié)。當(dāng)機體組織發(fā)生損傷時，會釋放多種趨化因子、炎癥因子、黏附因子等。MSCs表面相應(yīng)受體結(jié)合以上這些細(xì)胞因子后，可驅(qū)動MSCs向損傷部位遷移與定植。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)與其相應(yīng)的CXCL趨化因子配體4(CXCL4)形成的SDF-1/CXCL4軸，是調(diào)控MSCs向損傷部位遷移歸巢最重要的生物軸[16]。SDF-1/CXCL4可抑制MSCs凋亡，提高M(jìn)SCs的活化率及增殖率。提高M(jìn)SCs的歸巢率是保障其治療效果的關(guān)鍵步驟，但目前MSCs歸巢、定植、分化的具體機制尚未闡明，且不同組織來源的MSCs顯示出不同的歸巢分子表達(dá)譜[17]，這使MSCs的組織工程學(xué)研究進(jìn)一步增加了難度。

2.4 免疫調(diào)節(jié)功能MSCs對T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞等均能發(fā)揮獨特的免疫抑制作用，進(jìn)而顯著抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生，這是MSCs異體移植的前提。大量研究表明，MSCs在體內(nèi)可分泌多種細(xì)胞因子，如前列腺素2(PGE2)、腫瘤壞死因子、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)、白介素-6(IL-6)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、一氧化碳(NO)等，調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的增殖、分化。

2.5 抗炎功能MSCs能通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、抑制NK細(xì)胞活化、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化等途徑抑制血液循環(huán)與損傷組織中的促炎因子的生成，如IL-6、IL-1、TNF、干擾素γ(IFN-γ)等，同時MSCs分泌的抗炎因子，如IL-4、IL-10、TGF-β等可有效減輕局部或全身炎癥反應(yīng)，從而減少炎癥細(xì)胞和炎癥因子對組織造成的急性損傷。

2.6 促進(jìn)血管新生MSCs具有成血管作用，對組織損傷[18]、心肌梗死等缺血性疾病均有較好療效。MSCs不僅可以自身分化，表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物參與損傷組織新生血管形成，還可以直接整合到血管上[19]。整合后的細(xì)胞大部分可以分泌促進(jìn)新生血管生成生長因子，如血管內(nèi)皮長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素(angiopoietin,Ang)等調(diào)節(jié)內(nèi)皮系的干/祖細(xì)胞向成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，通過分泌功能促進(jìn)血管再生。

2.7 旁分泌功能MSCs的旁分泌功能首先在心肌梗死的小鼠模型提出[20]，MSCs移植后心肌梗死面積顯著縮小，然而損傷的心肌部位未發(fā)現(xiàn)MSCs分化的心肌細(xì)胞，且進(jìn)入體循環(huán)的MSCs大多數(shù)滯留在肺部和肝臟，只有很少部分到達(dá)損傷的心肌組織。MSCs可旁分泌多種生物活性因子發(fā)揮強大的治療作用，例如HGF、TGF-β等。近年來研究證實，MSCs衍生的外泌體同樣具有強大的抗炎、促進(jìn)血管生成、抗凋亡等作用，同時外泌體的免疫原性及移植不良反應(yīng)遠(yuǎn)低于其他給藥方式，規(guī)避了MSCs細(xì)胞治療的安全性及細(xì)胞存活率等問題，未來MSCs的旁分泌功能或許會成為新的研究熱點，但仍需要大量的研究和臨床試驗。

3 MSCs治療AP的作用機制

MSCs治療AP的具體機制尚不明確，目前的基礎(chǔ)研究提示其主要機制包括直接修復(fù)和間接修復(fù)兩個方面。

3.1 直接修復(fù)

3.1.1 MSCs向損傷部位趨化、定植、分化：目前有研究[21]證實，MSCs可作為“種子細(xì)胞”在AP中向損傷部位趨化，定植于受損的胰腺并可分化成為胰腺“靶組織細(xì)胞”、胰腺干細(xì)胞、腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞、胰島細(xì)胞而發(fā)揮組織修復(fù)作用。目前多采用熒光染料標(biāo)記技術(shù)、基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記技術(shù)、CM-Dil等進(jìn)行MSCs體內(nèi)示蹤。Qu等[21]將熒光染料PKH26標(biāo)記的MSCs移植到AP大鼠體循環(huán)內(nèi)，在胰腺組織發(fā)現(xiàn)PKH26標(biāo)記MSCs，同時移植的MSCs表達(dá)胰腺干細(xì)胞表面分子標(biāo)記(Pax-4、Nkx-6、Ngn3)，證明MSCs歸巢到損傷組織后分化為有功能的胰腺干細(xì)胞，對損傷的組織進(jìn)行修復(fù)，同時證明了體內(nèi)注射粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)可以促進(jìn)MSCs向損傷胰腺組織的歸巢、定植、分化。

MSCs的歸巢受到多種因素的調(diào)控，目前認(rèn)為SDF-1/CXCR4軸是促進(jìn)MSCs向損傷組織歸巢最重要的生物軸。Gong等[22]發(fā)現(xiàn)，給予抗趨化因子受體4(CXCR4)抗體干預(yù)后MSCs的歸巢率及胰腺組織的修復(fù)水平明顯降低。有研究[23]將MSCs的CXCR4基因過表達(dá)后應(yīng)用于急性心肌梗死大鼠模型，結(jié)果顯示，CXCR4過表達(dá)組MSCs的歸巢細(xì)胞數(shù)量是未轉(zhuǎn)染組的3倍。以上研究均證實了SDF-1/CXCR4軸在MSCs體內(nèi)歸巢中的重要地位。

3.2 間接修復(fù)

3.2.1 MSCs抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用：AP中局部的炎癥會使各種炎癥細(xì)胞趨化，不同的促炎細(xì)胞因子數(shù)量急劇增加，如IL-6、TNF-α等。大量研究證實，MSCs移植后可以顯著降低血清及組織的促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的數(shù)量，增加抗炎因子(IL-4、IL-10)的數(shù)量。Qian等[24]研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-9修飾的BMSCs可以通過抑制NF-κB信號通路降低局部組織及血清中促炎因子[TNF-α、IL-1β、IL-6、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、髓過氧化物酶(MPO)]的水平，增加抗炎細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、TGF-β)的水平，減輕SAP胰腺組織損傷程度，減輕局部或全身炎癥反應(yīng)。

3.2.2 MSCs保護(hù)腺泡細(xì)胞、抗凋亡：腺泡細(xì)胞死亡是AP疾病發(fā)生、發(fā)展中重要的病理變化，胰腺腺泡細(xì)胞死亡方式一直是AP研究的熱點。Nagaishi等[25]證明了人羊膜MSCs能減輕牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)的大鼠SAP模型胰腺組織腺泡細(xì)胞損傷或壞死。關(guān)于MSCs減輕腺泡細(xì)胞凋亡與壞死的機制還有待進(jìn)一步研究，最近研究表明[26]，MSCs分泌的miR-181a-5p可通過張力蛋白同源物基因(PTEN)/蛋白激酶(Akt)/TGF-β1通路，發(fā)揮抗凋亡作用，促進(jìn)損傷的胰腺組織再生。Song等[27]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-9的BMSCs移植后可顯著減輕SAP大鼠胰腺組織的程序性死亡。以上研究均證明MSCs能減少AP模型中胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。

3.2.3 MSCs促進(jìn)組織血管新生：MSCs能通過促進(jìn)損傷胰腺血管新生，加速胰腺組織修復(fù)。Qian等[24]研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1α能顯著刺激BMSCs中Ang-1和CXCR4的表達(dá)，證明了MSCs在SAP大鼠中通過SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)胰腺組織血管新生進(jìn)而促進(jìn)損傷胰腺組織修復(fù)。He等[28]同樣證明BMSCs促進(jìn)脫氧膽酸鈉誘導(dǎo)SAP模型損傷胰腺血管新生，同時發(fā)現(xiàn)BMSCs敲除TSG-6基因后對胰腺組織的修復(fù)作用消失。

3.2.4 MSCs對胰島的保護(hù)作用：AP時，由于胰島β細(xì)胞受損，胰島細(xì)胞功能失調(diào)甚至喪失，導(dǎo)致糖耐量受損或胰島功能抵抗，且機體血糖升高與AP嚴(yán)重程度密切相關(guān)。高血糖可導(dǎo)致繼發(fā)性感染惡化，而難以控制的感染常誘發(fā)機體胰島素抵抗[29]，形成惡性循環(huán)，加速疾病進(jìn)展。MSCs能通過提供由旁分泌作用改善胰島細(xì)胞微環(huán)境，減少內(nèi)源性胰島β細(xì)胞壞死及凋亡，促進(jìn)胰島β細(xì)胞的修復(fù)再生[30]，從而改善外周組織的胰島素抵抗。

4 提高M(jìn)SCs治療效果的可行方案

盡管MSCs在臨床上已應(yīng)用于治療多種疾病，但MSCs在體內(nèi)歸巢率和存活率較低，治療效果尚不滿意。目前已有多種研究嘗試通過不同的方法增強MSCs的治療效果，包括體外對MSCs急性基因編輯和預(yù)處理等。

Yang等[31]證明，血管緊張素Ⅱ預(yù)處理人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Ang-Ⅱ-MSCs)后可通過分泌VEGF促進(jìn)損傷胰腺組織血管新生。研究證明，將MSCs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后通過增加MSCs的PGE2分泌能力增強其免疫調(diào)節(jié)能力。Hua等[32]證明了Ang-1基因過表達(dá)的MSCs較過表達(dá)前的MSCs更能有效促進(jìn)胰腺組織新生血管的形成。Qian等[33]證明，miR-9修飾的BMSCs通過誘導(dǎo)胰腺組織血管生成治療SAP。

5 結(jié)論及展望

綜上，MSCs移植作為一種新型的治療方法，治療AP可能成為一種革命性的新治療手段。但目前MSCs治療AP仍局限于動物實驗階段，尚未進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化，動物實驗中發(fā)現(xiàn)在AP的治療中可以通過抗炎、抗凋亡、抗氧化、再生胰腺細(xì)胞、增加胰腺組織血管密度來改善AP預(yù)后，然而仍有許多有待解決的問題在不斷探索中，如建立MSCs的規(guī)范化生產(chǎn)流程，包括MSCs的組織來源、鑒定手段、培養(yǎng)、傳代等；細(xì)胞移植的時間、數(shù)量、頻率、給藥間隔時間、途徑等；MSCs的動員與歸巢；MSCs的遠(yuǎn)期預(yù)后及安全性等。因此，了解MSCs治療AP的具體機制是未來廣泛使用MSCs治療AP的前提和基礎(chǔ)。