1,25(OH)2D3對非酒精性脂肪性肝病腸道菌群及免疫調(diào)節(jié)的研究進展

黃紅洽，李校天

1.河北工程大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056000； 2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一類多系統(tǒng)疾病，可增加2型糖尿病、腸道疾病、慢性腎臟疾病、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病風(fēng)險[1]。其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及NASH相關(guān)性肝硬化和肝細胞癌。人群中病毒性肝病的發(fā)病率顯著降低，但NAFLD發(fā)病率卻持續(xù)升高[2]，位于我國肝臟疾病之首[3]，是當(dāng)前全球關(guān)注的疾病之一。單純依賴個體運動及生活方式調(diào)節(jié)具有明顯局限性，目前亟需明確的臨床治療藥物，因此探索NAFLD發(fā)病機制尤為重要。

1 腸道菌群及其功能

1.1 腸道菌群概述自胎兒早期，原腸胚的內(nèi)胚層發(fā)育形成肝臟，腸道血液經(jīng)膽管、門靜脈系統(tǒng)流入肝臟進行解毒，胃腸道和肝臟系統(tǒng)之間便存在著菌群聯(lián)系[4]。腸道菌群包含1 000余種常駐的細菌[5]，約占人體內(nèi)微生物總數(shù)的70%，占腸道微生物99%以上，主要包括原生動物、古細菌、真核生物、病毒、寄生蟲等。正常情況下，個體的腸道菌群是相對穩(wěn)定的[6]，與宿主、環(huán)境處于動態(tài)平衡狀態(tài)，發(fā)揮著抗感染、營養(yǎng)代謝、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用[7-10]，當(dāng)發(fā)生菌群紊亂時，誘導(dǎo)腸道菌群和宿主發(fā)生相互作用，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，促進脂肪肝形成。最新研究表明，腸道菌群對維生素D3具有羥基化作用，在維生素合成中作用顯著，且維生素D3對腸道菌群也有調(diào)節(jié)作用，兩者相互影響[11]。

1.2 腸道菌群與NAFLD動物實驗[12]發(fā)現(xiàn)，菌群失衡在NAFLD中普遍存在，腸道菌群既是促炎、致病因素，又是治療手段，如肺炎克雷伯桿菌、某些球菌均可增加脂肪肝的嚴(yán)重程度[13-15]，Odoribacter和Alistipes桿菌百分比與NASH呈反向關(guān)聯(lián)[16]。一項涵蓋1 148例NAFLD患者的臨床研究[17]表明，F(xiàn)aecalibacterium減少與NAFLD形成密切相關(guān)，且在隨機臨床試驗[18-19]中用益生菌治療后，NAFLD患者的脂肪變性程度及氨基轉(zhuǎn)移酶活性顯著降低。此外，Miele等[20]在35例病理活檢證實的NAFLD患者中發(fā)現(xiàn)小腸細菌過度生長檢出率高達60%，是正常人的2倍，伴腸黏膜通透性明顯增加。腸道微生物代謝產(chǎn)物也可對疾病發(fā)展造成影響，如增強腸黏膜屏障和脂代謝，減輕肝損傷等[21]。因此，菌群干預(yù)可能作為治療NAFLD發(fā)生和進展的新靶點[22]。與抗生素、糞便移植法相比，益生菌具有不良反應(yīng)較小的優(yōu)勢，無疑成為調(diào)節(jié)菌群失調(diào)的最佳選擇。

2 維生素D3代謝與功能

在哺乳動物體內(nèi)，維生素D3不存在生物活性，需要利用細胞色素酶P450s(CYPs)進行羥基化轉(zhuǎn)化為25-OHVD3及l(fā)a,25-(OH)2VD3的活性形式，才能在機體內(nèi)發(fā)揮功能。維生素D3多以25-羥維生素D3形式存在于血液中，并在腎臟中經(jīng)CYP2B1(1a-羥化酶)代謝，最終轉(zhuǎn)化成為具有生物活性的1,25(OH)2D3。研究發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3不僅可以調(diào)節(jié)鈣磷代謝、抗氧化，還具有調(diào)節(jié)腸道菌群[11]，免疫調(diào)節(jié)[23]，保護腸黏膜屏障[24]，抗細菌感染及調(diào)節(jié)蛋白表達[25]等重要作用，進而調(diào)節(jié)腸道菌群，干預(yù)NAFLD進展。腸道上皮細胞屏障是1,25(OH)2D3發(fā)揮菌群及免疫調(diào)節(jié)作用，預(yù)防不可控炎癥反應(yīng)的重要部分[26]，腸道上皮屏障包括免疫屏障、機械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障，以前兩者作用顯著。同時，還發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3可使腸-肝循環(huán)中膽汁酸轉(zhuǎn)運體下調(diào)，內(nèi)源乙醇生成減少，膽堿可用性降低等，從而抑制脂質(zhì)沉積。目前我們團隊著重1,25(OH)2D3對NAFLD患者固有免疫方面進行蛋白組學(xué)、基因組學(xué)及代謝組學(xué)研究。

2.1 維生素D3與免疫調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)由先天性免疫和獲得性免疫構(gòu)成，可以抵抗多種病原體，前者又稱為固有免疫，在免疫屏障中發(fā)揮最主要作用，Paneth cells(PC)是固有免疫的最主要效應(yīng)細胞。多項研究表明，1,25(OH)2D3是固有免疫的重要調(diào)節(jié)劑，可直接或通過刺激回腸PC及免疫細胞表面大量表達的維生素D受體(VDR)間接作用于PC，使其分泌大量抗菌肽(AMPs)，發(fā)揮自噬功能，參與腸道免疫調(diào)節(jié)[23，27]，如在人類和靈長類動物中，1,25(OH)2D3與巨噬細胞和上皮細胞表面VDR結(jié)合后可強烈誘導(dǎo)細胞中cathelicidin AMP(CAMP)基因的表達[28]。AMPs也稱宿主防御肽(HDP)，是先天免疫的第一線，具有免疫調(diào)節(jié)活性，通過NF-κB、VDR、MAPK等多種信號通路起作用，對細菌、真菌、病毒及寄生蟲均具有活性，常儲存在大的細胞質(zhì)顆粒中，后釋放到小腸隱窩腔，累積殺死微生物、限制共生菌群的炎癥反應(yīng)，為宿主防御作用提供支持[29-30]。另外，VDR在PC和多數(shù)免疫細胞表面均大量表達，也提示活性維生素D3對宿主小腸免疫細胞增殖、分化及固有免疫及腸道菌群調(diào)節(jié)作用顯著。

1,25(OH)2D3可刺激PC表達α防御素(隱窩素)、溶菌酶、凝集素RegⅢ-γ、分泌型磷脂酶A2(sPLA2)、cathelicidin LL-37及杯狀細胞分泌的糖蛋白等抗菌多肽。PC位于小腸隱窩底部，緊鄰腸上皮干細胞，參與介導(dǎo)免疫反應(yīng)，如PC在其基底外側(cè)膜上表達CD95或FAS配體，可誘導(dǎo)周圍組織的FAS+免疫細胞凋亡；AMPs不僅具有抗內(nèi)毒素的作用，還可抑制促炎細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-22等的水平，調(diào)節(jié)趨化因子的表達，促進血管生成及傷口修復(fù)[31]；還可激活并募集巨噬細胞、樹突狀細胞及T細胞等免疫細胞，誘導(dǎo)免疫細胞分化[29,32]；中和促炎細胞因子從巨噬細胞和單核細胞釋放、肥大細胞脫落等[30]。

多項研究表明，充足的活性維生素D3不僅可以刺激AMPs表達、維持腸道菌群平衡、抵抗腸道黏膜通透性改變、防止大量細菌及其代謝產(chǎn)物L(fēng)PS、DAO、D-乳酸等入血[33]；還是增強固有免疫的必要條件，可刺激免疫細胞表面應(yīng)答的模式識別受體NOD2、AMPs及關(guān)鍵細胞因子基因轉(zhuǎn)錄表達[34]，減少細胞因子釋放、抑制肝臟TLR4等炎癥通路[35]，以及阻礙復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程、減少翻譯因子及前體細胞合成、抑制肽聚糖和蛋白激酶NF-κB活性等途徑干預(yù)免疫反應(yīng)，延緩NAFLD[30]。反之，維生素D3缺乏可導(dǎo)致腸黏膜固有層免疫細胞及抗菌肽數(shù)量更加減少、活性極大降低、黏膜通透性增加，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致菌群失衡、肥胖及NAFLD形成。

獲得性免疫常發(fā)生在固有免疫之后，經(jīng)抗原提成細胞作用后才能啟動的免疫功能，主要表現(xiàn)為固有層漿細胞分泌抗菌肽—分泌型免疫球蛋白A(SIgA)，后者可以招募、激活樹突細胞、巨噬細胞等抗原呈遞細胞，調(diào)節(jié)獲得性免疫系統(tǒng)。

2.2 維生素D3與腸上皮細胞屏障1,25(OH)2D3除了可作用于免疫屏障，還同時對機械屏障和化學(xué)屏障有影響，腸道上皮細胞及細胞間連接構(gòu)成腸道機械屏障，1,25(OH)2D3不僅可以上調(diào)腸道上皮緊密連接蛋白Claudin-2表達，還能增強單層細胞間黏附連接、緊密連接的完整性，防止菌群移位[36]。

研究還表明，維生素D還可刺激腸上皮細胞大量分泌黏多糖(mucin，MUC2)及表皮黏附蛋白，分泌物質(zhì)黏附于腸黏膜表面，形成化學(xué)屏障，進而維持黏膜通透性完整和腸道微生態(tài)平衡[37]。維生素D缺乏時，黏多糖和表皮黏附蛋白表達下降，腸道通透性明顯增加，甚至黏膜萎縮，伴防御素的激活酶(基質(zhì)金屬蛋白酶7)下降，導(dǎo)致腸道防御系統(tǒng)失衡，進而引發(fā)腸道微生物系統(tǒng)失衡，作用于NAFLD形成。

3 維生素D3在NAFLD治療中的價值

研究表明，維生素D3具有延緩NAFLD的作用[38]，且腸道菌群在過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Kim等[39]篩選了1988-1994年4 015例確診為NAFLD的患者進行了長達19年的隨訪，發(fā)現(xiàn)維生素D水平與肝臟脂肪變性程度呈顯著負相關(guān)(P<0.01)，活性維生素D3是阻止肝臟脂質(zhì)堆積、NAFLD發(fā)展的保護因素[40]。16S RNA測序及宏基因組分析數(shù)據(jù)均表明，維生素D3可大范圍影響腸道菌群平衡，如維生素D3缺乏(VDD)和CYP27B1-/-小鼠[41]的肝螺旋桿菌屬細菌數(shù)目顯著增加。而且，VDR基因敲除小鼠(VDR-/-)[41]與其有相似的表型，表現(xiàn)為肝螺桿菌數(shù)目增加、阿克曼菌數(shù)目降低及腸α-防御素5下降，伴腸道黏膜脫落和脂肪肝形成。向高脂肪喂養(yǎng)的小鼠提供充足的維生素D3僅出現(xiàn)輕微脂肪肝，而VDD小鼠不僅表現(xiàn)出肝臟脂肪變性，甚至形成肝臟炎癥、纖維化[42]，另外，研究發(fā)現(xiàn)維生素D可上調(diào)VDR表達，進而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。此外，研究表明VDR-/-小鼠對脂多糖的敏感性顯著升高，ZO-1、E-cadherin、Occludin、Claudin-1等連接蛋白表達下降明顯[38，40]。同時，維生素D3和腸道菌群具有協(xié)同作用，在免疫調(diào)節(jié)方面也顯示出很多相似之處，NAFLD可能會受益于兩者之間的協(xié)同作用[11]。

綜上所述，1,25(OH)2D3對腸道菌群及免疫調(diào)節(jié)極其重要，可能通過干預(yù)腸道菌群及腸道屏障途徑延緩NAFLD的發(fā)生或發(fā)展，進而發(fā)揮NAFLD治療作用。另外，新型冠狀病毒肺炎[43]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[44-45]、過敏性疾病[46]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[47-48]、心血管疾病[49]等均與腸道菌群密切相關(guān)，因此，我們更應(yīng)該重視腸道菌群在疾病中的地位，為疾病診治服務(wù)。

4 展望

目前NAFLD發(fā)病率在全球仍呈持續(xù)上升趨勢，該疾病治療屬熱門研究領(lǐng)域。大量臨床試驗表明，1,25(OH)2D3可以減輕脂肪肝，然而它具有多重生物學(xué)功能，且NAFLD形成是多種細胞因子和通路共同作用的結(jié)果，因此充分探究或明確1,25(OH)2D3具體作用機制尤為重要。腸道菌群和腸道屏障在NAFLD發(fā)展中的作用顯著，兩者可相互作用，是1,25(OH)2D3發(fā)揮作用的重要因素。腸道菌群和腸道屏障之間的作用極其復(fù)雜，以后可以進一步深入探究1,25(OH)2D3與腸道菌群、1,25(OH)2D3與各腸道屏障、各腸道屏障與腸道菌群之間的可能影響機制，發(fā)現(xiàn)最主要作用機制及途徑，并針對性地進行相應(yīng)動物及臨床試驗驗證，為臨床治療提供更可靠的治療理論和方法。臨床上免疫相關(guān)性疾病類型繁多，一直是醫(yī)學(xué)史上較難攻克的課題，且黏膜免疫系統(tǒng)構(gòu)成了機體的第一道防線，本文主要從腸道固有免疫屏障和免疫調(diào)節(jié)方面闡述，希望能為發(fā)現(xiàn)NAFLD治療的臨床藥物提供新思路。此外，隨著實驗方法和檢測技術(shù)的不斷進步，人類已成功將寬泛的腸道菌群研究由多種、單種深入到亞種水平菌落；透射電子顯微鏡和掃描電鏡可以幫助我們觀察到腸道黏膜，甚至腸道屏障的超微觀組織結(jié)構(gòu)及變化，我們期待未來可以有更深入的研究來證實，為臨床NAFLD治療提供有效藥物。