豬細小病毒分子生物學(xué)檢測方法的研究進展

余同江 陳 堅

（廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州 511356）

豬細小病毒病是由豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）引起豬的繁殖障礙疾病，主要引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、畸形胎及弱仔等，亦可引起仔豬皮炎、腹瀉及呼吸系統(tǒng)疾病，在斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征中也起重要作用[1]。該病廣泛分布于世界各地，并在大多數(shù)豬場呈地方性流行，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR、核酸探針、LAMP、RPA和基因芯片等檢測方法都已應(yīng)用到豬細小病毒的檢測中，但在實際臨床應(yīng)用中，由于各地的實驗條件存在差異，因此有必要挑選適合的方法進行檢測。

1 常規(guī)PCR方法

常規(guī)PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）是一種DNA體外擴增技術(shù)，通過瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物以實現(xiàn)快速診斷，是目前臨床應(yīng)用較廣泛的檢測方法。鄒敏等[2]參考VP2基因建立了PPV的PCR檢測方法，符合性結(jié)果顯示：該PCR方法優(yōu)于HA、VI以及IHA。使用該方法對215份病料進行了檢測，檢出陽性樣品25份，檢出率為 11.63%。Li等[3]通過序列分析、引物設(shè)計和參數(shù)優(yōu)化，建立了CSFV、JEV、PRRSV、PCV2、PRV和PPV的多重PCR檢測方法，最低可檢測濃度為10-3ng/μl，具有很高的特異性，臨床檢測結(jié)果與單次PCR結(jié)果一致。

2 實時熒光定量PCR方法

熒光定量 PCR 方法可分為熒光染料和熒光探針，具有操作簡便、敏感性高、快速高效等優(yōu)點，完全閉管操作污染小，可實時監(jiān)測分析數(shù)據(jù)，結(jié)果更為準確、直觀。陳堅等[4]建立了PPV的SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測方法。結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性，檢測PRRSV、CSFV、PRV、PCV2和SIV均為陰性；其最低檢出量為7 copies/μl，且批內(nèi)和批間重復(fù)性良好。用該方法與常規(guī)PCR、LAMP方法對臨床病料進行檢測對比，顯示該方法靈敏度高、成本低。Song等[5]建立了一種基于TaqMan探針的PPV實時定量PCR檢測方法，其檢出限為1×102copies/μl，與PCV2、PRRSV、PRV、CSFV和JEV無交叉反應(yīng)。該方法具有特異性和重現(xiàn)性。在41例臨床標本中，用該方法檢測到32例PPV，而用常規(guī)PCR方法檢測到11例PPV。

3 核酸探針方法

核酸探針方法是利用堿基互補原理檢測目的核酸片段，具有敏感性高、特異性強的特點，不僅是研究核酸結(jié)構(gòu)和功能的重要手段，還可進行傳染病的早期診斷。Krell P J等[6]率先用32P標記的探針檢測細胞培養(yǎng)物中的PPV，最低可檢出 0.1pg 的DNA，其敏感度是HA的100倍。白紅光等[7]利用地高辛標記制備了兩種PPV核酸探針檢測方法，特異性試驗結(jié)果表明，這兩種探針都能與PPV DNA發(fā)生特異的陽性雜交，而與對照的PRV、PCV、PRRSV和HCV的核酸雜交呈陰性。敏感性試驗結(jié)果表明，克隆NS1探針敏感度為0.5 pg /μl，NS1基因PCR產(chǎn)物探針敏感度為1 pg/μl。

4 LAMP方法

LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫擴增）方法是日本學(xué)者NOTOMI等發(fā)明的一種體外等溫擴增特異核酸片段的技術(shù)。在等溫條件下，基因的擴增和產(chǎn)物的檢測可一步完成，擴增效率和特異性高，該方法用時短，對設(shè)備要求低。ZHAO等[8]建立了可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測PPV感染的方法。擴增產(chǎn)物用SYBR GreenⅠ染料染色后目測和常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳分析，兩種方法的靈敏度相同。LAMP法檢測PPV的檢出限為10 copies，比常規(guī)PCR方法低100倍。該檢測方法與其他病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，對1100個現(xiàn)場樣本進行檢測，檢測到660個陽性。胡瑞麗[9]建立了檢測PPV的LAMP方法并研制了試劑盒，用該檢測試劑盒對臨床樣品進行PPV的檢測限為10 copies/μl，而常規(guī)PCR檢測法的檢測限為1000 copies/μl，該方法不會與PCV2、PRRSV、PRV和CSFV發(fā)生交叉反應(yīng)。用該檢測試劑盒對1100個臨床樣品進行檢測，320個樣品為陽性。

5 重組酶聚合酶（RPA）方法

重組酶聚合酶（RPA）方法是由PIEPENBURG等研發(fā)的一種由多種酶和蛋白的參與下，在恒溫條件下實現(xiàn)核酸指數(shù)擴增的技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強、反應(yīng)快速等特點。該方法可通過與試紙條、探針或凝膠電泳等相結(jié)合的方式，實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的定量分析或可視化判別。劉立兵等[10]建立了38℃恒溫水浴鍋檢測PPV的RPA方法，在恒溫反應(yīng)30min，能夠特異性的檢測PPV；以重組質(zhì)粒pPPV-VP2作為模板，RPA的檢測限為102拷貝，同研究中應(yīng)用的實時熒光定量PCR方法檢測限一致，比普通PCR方法高100倍；該方法對疑似PPV感染臨床樣品的陽性檢出率為82.6%，略低于實時熒光定量PCR（86.9%），明顯高于普通PCR（66.7%）。WANG等[11]建立了檢測PPV的實時RPA方法，在39℃下反應(yīng)20 min，與其它病原無交叉，最低可檢測103拷貝的重組質(zhì)粒。用該方法與實時PCR方法平行檢測115份樣品，兩種檢測方法的符合率為100%。

6 基因芯片方法

基因芯片又稱DNA芯片（DNA chip）或DNA微陣列，是將cDNA或寡核苷酸按微陣列方式固定在微型載體上制成。將分子生物學(xué)技術(shù)、計算機技術(shù)以及標記融于一體，可對DNA樣品的序列信息進行高效的解讀和分析，具有快速、高特異性、高靈敏性、高通量、多樣性等特點。吳鳳筍等[12]以VP2基因為目的基因設(shè)計引物和探針建立了PPV的基因芯片檢測方法，根據(jù)熒光信號的強度來確定是否存在PPV，檢測靈敏度可達34.5 ng/μl；同時用制備的基因芯片對臨床20份疑似PPV感染的病料進行檢測，檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果符合率達100%。劉勝利[13]基于PCV2、PRRSV、PPV、JEV和CSFV的保守區(qū)域設(shè)計引物與探針，將探針噴點固化于醛基化基片上并進行后期處理，制備出寡核苷酸芯片。同時確立了最佳雜交反應(yīng)條件為55℃雜交箱雜交2h，且探針濃度在1μM時即可得到較好的雜交信號。敏感性試驗結(jié)果表明該診斷方法達到了10-5ng級，臨床試驗結(jié)果與多重PCR檢測結(jié)果符合率達100%。

7 結(jié)語

在非洲豬瘟新常態(tài)下，更加需要嚴格做好豬場PPV的檢測和防控。雖然目前多種分子生物學(xué)檢測方法已應(yīng)用于PPV的臨床檢測，但不同的檢測方法也存在一定的局限性，有時需將幾種檢測方法結(jié)合起來，綜合判斷，才能得到準確的檢測結(jié)果。相信隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷發(fā)展，更快速、準確、簡便的方法會在臨床檢測中發(fā)揮更重要的作用。