肺癌患者血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因的檢測分析

唐華，廖洪春，岑玉蘭，廖光付，唐際富

1廣西科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣西柳州 545006；2廣西壯族自治區(qū)龍?zhí)夺t(yī)院；3廣西壯族自治區(qū)胸科醫(yī)院

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，也是全球范圍內(nèi)癌癥死亡的首要原因，嚴重威脅人類健康[1]。肺癌的治療包括手術(shù)治療、化療及分子靶向治療等，但晚期肺癌患者預(yù)后較差[2]。腫瘤的發(fā)生與原癌基因的激活、抑癌基因的失活有關(guān)，而腫瘤相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)修飾如甲基化、乙?；⑻腔仁钦{(diào)控基因表達的重要機制。研究[3,4]表明，通過檢測患者外周血、支氣管肺泡灌洗液(BALF)及癌組織標(biāo)本中抑癌基因甲基化情況，有助于肺癌的早期診斷。但支氣管鏡下活檢獲取的癌組織標(biāo)本可能會因取材位置不當(dāng)，出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。BALF雖能大面積沖洗收集脫落的腫瘤細胞，但仍需支氣管鏡下操作，具有一定的創(chuàng)傷性。而血漿標(biāo)本容易獲取，檢測血漿標(biāo)本中游離DNA的異常改變，具有較高的臨床價值。矮小同源盒基因2(SHOX2)基因位于3q25.32，是同源盒基因家族的成員，編碼蛋白包含DNA結(jié)合域，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控基因表達，影響組織器官的生長發(fā)育及分化。SHOX2基因是雙向調(diào)控基因，在特定組織類型中發(fā)揮抑癌基因的作用，其甲基化沉默與肺癌關(guān)系密切，甲基化SHOX2基因檢測有望成為肺癌早期篩查的指標(biāo)[5]。RAS相關(guān)區(qū)域家族1A(RASSF1A)基因位于3p21.31，是典型的抑癌基因，其CpG島啟動子區(qū)域的高甲基化失活參與肺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，檢測甲基化RASSF1A基因有可能成為肺癌的診斷治療新靶點[6]。本研究檢測了肺癌患者甲基化SHOX2、RASSF1A基因，并探討其意義。

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1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月～2019年1月廣西科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的肺癌患者92例(觀察組)，男60例，女32例；年齡42～76(53.2±6.7)歲；病理類型：肺腺癌37例，肺鱗癌33例，小細胞肺癌22例；腫瘤分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期33例，Ⅲ期25例，Ⅳ期13例。腫瘤分化程度：高分化21例，中分化36例，低分化35例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例。納入標(biāo)準：①經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為肺癌；②均為初次診治，既往未接受過任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整。排除標(biāo)準：①同時合并有感染性疾病，如呼吸系統(tǒng)感染等；②伴其他器官系統(tǒng)惡性腫瘤；③合并嚴重的心肺肝腎等臟器功能障礙。另選68例肺部良性疾病患者作對照(對照組)，男41例，女27例；年齡43～78(54.6±6.1)歲；疾病類型：肺結(jié)核30例，肺炎性假瘤23例，間質(zhì)性肺病8例，肺結(jié)節(jié)病7例?；颊呒凹覍倬橥獠⒑炞?，且本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準通過。

1.2 血漿、BALF、癌組織甲基化SHOX2和RASSF1A基因檢測 采用甲基化特異PCR法。①血漿中甲基化SHOX2、RASSF1A基因檢測：所有入選對象入院后術(shù)前清晨抽取空腹靜脈血約10 mL，2 h以內(nèi)以5 000 r/min的速度離心10 min，離心半徑10 cm，吸取上層血漿，-80 ℃條件下保存待測。采用游離DNA提取試劑盒提取血漿中DNA。DNA的OD260/OD280比值一般為1.7～1.9。應(yīng)用亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA，實驗步驟嚴格按照EZ DNA Methylation-Gold Kit說明書進行，將DNA中尚未甲基化的胞嘧啶(C)修飾為尿嘧啶(U)，50 ℃條件下水浴過夜，乙醇沉淀，DEPC水重懸后進行甲基化特異PCR。MS-PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸8 min，共40個循環(huán)?？偡磻?yīng)體系50 μL，DNA模板10 μL，緩沖液2.5 μL，Taq酶2 U，dNTPs 4 μL，MgCl 4 μL，上游及下游引物各1 μL，PCR結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳，以去離子水為陰性對照，應(yīng)用紫外成像分析系統(tǒng)照相。應(yīng)用Image J軟件對甲基化及非甲基化條帶的灰度值進行統(tǒng)計，計算甲基化條帶/非甲基化條帶灰度值比值。根據(jù)DNA條帶判斷結(jié)果，甲基化陽性：甲基化引物擴增出目的條帶，而非甲基化引物未擴增出目的條帶。甲基化陰性：非甲基化引物擴增出目的條帶，甲基化引物未擴增出目的條帶。②BALF中甲基化SHOX2、RASSF1A基因檢測：所有入選對象入院后均接受纖維支氣管鏡檢查，采取BALF，首先向要灌洗的肺段注入2%利多卡因1 mL進行局部麻醉，然后經(jīng)活檢孔向病變肺段注入50 mL生理鹽水(NS)，負壓吸引回收至瓶子中，重復(fù)2次，回收量≥40 mL，將濾液置于離心管，以2 000 r/min速度離心10 min，離心半徑10 cm，去上清液，沉淀細胞團用500 μL～1 mL細胞保存液懸浮，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Eppi管，-80 ℃下保存待測。采用細胞基因組DNA抽提試劑盒抽提BALF細胞DNA，抽提DNA后實驗步驟同“①”。③癌組織中甲基化SHOX2、RASSF1A基因檢測：收集所有入選對象術(shù)中新鮮獲取的組織標(biāo)本，置于凍存管中液氮速凍，轉(zhuǎn)運置實驗室后-80 ℃條件下保存待測。采用組織基因組DNA抽提試劑盒抽提冰凍新鮮組織中DNA，抽提DNA后實驗步驟同“①”。

連刀鋒的軌跡都看不清楚，這便意味著，自己連最基本的防守都做不到，自己身體的某個部位，很可能在接下來的交鋒中，毫無察覺地被對方扯碎，而自己卻只能后知后覺。

2.4 血漿與癌組織、BALF中甲基化SHOX2、RASSF1A基因的一致性 血漿、癌組織、BALF中甲基化SHOX2基因陽性率分別為52.2%(48/92)、59.8%(55/92)、51.1%(47/92)，甲基化RASSF1A基因陽性率分別為55.4%(51/92)、64.1%(59/92)、53.3%(49/92);血漿中甲基化SHOX2基因陽性率與癌組織、BALF中的結(jié)果具有良好的一致性，一致率分別為87.3%(48/55)、97.9%(47/48);血漿甲基化RASSF1A基因陽性率與癌組織、BALF中的結(jié)果具有良好的一致性，一致率分別為86.4%(51/59)、96.1%(49/51)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因陽性率比較 觀察組血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因陽性率分別為52.2%(48/92)、55.4%(51/92)，對照組分別為2.9%(2/68)、5.9%(4/68)，兩組比較，P均<0.05。

2.2 血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因與肺癌臨床病理特征的關(guān)系 血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因與肺癌臨床病理特征的關(guān)系見表1。由表1可知，血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因陽性與肺癌腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。

通過專家法確定發(fā)生頻度、危害程度、檢測難度和維修難度這4個決策指標(biāo)對應(yīng)的決策權(quán)，分別為：η1=0.18，η2=0.28，η3=0.28，η4=0.26。

2.3 血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因?qū)Ψ伟┑脑\斷價值 根據(jù)ROC，以約登指數(shù)最大時，血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因診斷肺癌的最佳截斷值分別為1.234、1.379。血漿甲基化SHOX2單獨檢測診斷肺癌的靈敏度為53.7%、特異度為86.07%、陽性預(yù)測值為87.4%、陰性預(yù)測值為16.7%、AUC為0.812、95%CI為0.730～0.882，血漿甲基化RASSF1A基因單獨檢測診斷肺癌的靈敏度為64.1%、特異度為92.1%、陽性預(yù)測值為93.7%、陰性預(yù)測值為29.8%、AUC為0.748、95%CI為0.671～0.820，兩者聯(lián)合檢測診斷肺癌的靈敏度為81.6%、特異度為94.2%、陽性預(yù)測值為96.6%、陰性預(yù)測值為40.9%、AUC為0.911、95%CI為0.843～0.955。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因?qū)Ψ伟┑脑\斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

SHOX2大小約10 kb，又可分為2a、2b及2c三個亞型，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中SHOX2基因存在異常甲基化的現(xiàn)象，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平表達沉默，影響腫瘤細胞的生物學(xué)功能，因此甲基化標(biāo)記可能是腫瘤診斷的重要標(biāo)志物[10]。RASSF1A是一種重要的抑癌基因，腫瘤中此基因啟動子區(qū)CpG島處高甲基化是導(dǎo)致該基因失活的主要機制，引起腫瘤細胞無限增殖且凋亡抑制[11]。本研究顯示，觀察組血漿SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性率高于對照組，表明肺癌患者SHOX2基因的甲基化水平升高，但其機制尚不清楚，可能是結(jié)合于基因啟動子區(qū)CpG島處的轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄輔助因子異常后，導(dǎo)致甲基化位點暴露，CpG甲基化結(jié)合蛋白結(jié)合到基因啟動子區(qū)，促進其甲基化[12]。此外，血漿中甲基化SHOX2、RASSF1A基因陽性與肺癌腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明甲基化SHOX2、RASSF1A基因促進肺癌的發(fā)生發(fā)展，其原因是RASSF1A基因編碼的蛋白具有結(jié)合Ras蛋白的結(jié)構(gòu)域，并發(fā)揮抑制Ras信號傳導(dǎo)通路的作用，腫瘤發(fā)生時甲基化RASSF1A基因失活，導(dǎo)致腫瘤過度增殖[13]。而SHOX2基因編碼蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子，甲基化SHOX2基因失活后，下游上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換等癌基因表達明顯上調(diào)，促進腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移[14]。

肺癌是最常見惡性腫瘤，發(fā)病率為61.86/10萬，也是病死率最高的癌癥，約50.04人/10萬[7]。雖然早期篩查及早期治療有利于預(yù)防甚至治愈疾病，但是多數(shù)肺癌癥患者發(fā)現(xiàn)于中晚期，5年生存率僅17.8%，低于其他大多數(shù)癌癥[8]。臨床上可用于早期診斷肺癌的標(biāo)本包括血漿、BALF及癌組織活檢等，但臨床上相較于其他標(biāo)本，血漿標(biāo)本易獲取，對創(chuàng)傷小，患者容易接受，因此檢測血漿標(biāo)本中腫瘤標(biāo)志物的表達水平，具有較高的臨床價值。抑癌基因如RB轉(zhuǎn)錄抑制因子1、磷酸酶和張力蛋白同源物基因等的失活是腫瘤發(fā)生的重要原因，抑癌基因的失活涉及多種機制的參與，如基因突變、染色體雜合性丟失等。抑癌基因甲基化是近年來發(fā)現(xiàn)的新的調(diào)控基因表達的化學(xué)修飾方式，是在甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)下，將胞嘧啶裝變?yōu)?-甲基胞嘧啶，甲基化位點多位于基因5′端的CpG島處，而多種腫瘤中均存在基因異常甲基化的現(xiàn)象[9]。因而針對基因甲基化的研究可為臨床診斷、治療腫瘤提供指導(dǎo)。

以往文獻[5,15]報道，SHOX2和RASSF1A基因異常甲基化有助于腫瘤的早期診斷。本研究顯示，單獨檢測血漿甲基化SHOX2和RASSF1A基因診斷肺癌的靈敏度不高，而血漿甲基化SHOX2和RASSF1A基因聯(lián)合檢測診斷肺癌的靈敏度增加，表明聯(lián)合檢測對肺癌診斷具有較高的價值，有可能成為診斷肺癌的有效輔助工具。有學(xué)者報道，如血漿學(xué)指標(biāo)與細胞學(xué)檢測結(jié)合使用，能夠彌補細胞學(xué)檢查中診斷不能明確的情況，診斷肺癌的靈敏度和特異度分別提高至93.0%和94.7%[16,17]。

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臨床上對肺癌檢測的理想目標(biāo)是通過檢測血液中腫瘤指標(biāo)觀察腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程。腫瘤患者血漿DNA主要來自腫瘤組織釋放入血的DNA，近年來隨著基因技術(shù)的發(fā)展，檢測血漿DNA有助于腫瘤的早期診斷及致病基因的檢出。而BALF是一種非侵入性診斷標(biāo)本，易通過纖維支氣管鏡檢查獲得，由于其靠近腫瘤細胞，BALF亦可作為檢測腫瘤生物標(biāo)志物的替代手段。本研究對血漿與BALF、癌組織中甲基化SHOX2和RASSF1A基因檢測結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示血漿與BALF、癌組織中甲基化率具有良好的一致性，表明檢測血漿甲基化SHOX2和RASSF1A基因是一種可靠的檢測方式。

總之，肺癌血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因水平升高，兩指標(biāo)甲基化陽性與肺癌腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，聯(lián)合檢測兩者有助于提高對肺癌的診斷,血漿中甲基化SHOX2、RASSF1A基因陽性率與癌組織、BALF中的結(jié)果具有良好的一致性。