Mic60介導線粒體功能障礙在CKD發(fā)生發(fā)展中作用機制的研究進展

王錦，張愛青，甘衛(wèi)

華南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，南京210003

慢性腎臟病(CKD)是指持續(xù)3個月以上的腎臟結(jié)構(gòu)或功能異常，主要特征是腎功能的進行性喪失[1]。CKD的進展具有不可逆性，常發(fā)展為終末期腎臟病(ESRD)，且尚無有效治療手段可以逆轉(zhuǎn)該過程。近年來，CKD的患病率和病死率逐年上升。ESRD患者往往只能依賴透析或腎移植來延續(xù)生命。因此，迫切需要開發(fā)新的治療方法來預防或延緩CKD的發(fā)生發(fā)展。腎臟的生理功能高度依賴線粒體的穩(wěn)態(tài)，諸多證據(jù)證明線粒體功能障礙與CKD的病理生理過程有關(guān)[2]，包括腎小管損傷、氧化應(yīng)激、細胞凋亡、炎癥和纖維化等。線粒體功能障礙的一些特征性表現(xiàn)已在CKD中被發(fā)現(xiàn)，如線粒體內(nèi)膜重塑和線粒體形態(tài)的改變、線粒體氧化應(yīng)激的增強、線粒體生物發(fā)生和ATP生成的顯著減少[3 ,4]。目前關(guān)于線粒體功能障礙在CKD發(fā)生發(fā)展過程中的確切作用和機制仍需進一步探究，以期尋找新的治療靶點，改善CKD的臨床轉(zhuǎn)歸。線粒體內(nèi)膜蛋白Mic60介導的線粒體功能障礙可能是CKD發(fā)生的重要原因之一。Mic60具有維持內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、組織呼吸復合物、線粒體蛋白質(zhì)生物合成及運輸、線粒體內(nèi)外膜間磷脂轉(zhuǎn)移等功能。Mic60表達異常，不僅導致線粒體結(jié)構(gòu)崩解，“巨大線粒體”的形成，也可介導氧化磷酸化、線粒體動力學、生物發(fā)生等功能紊亂[5]，與CKD的發(fā)生密切相關(guān)。本文對Mic60介導線粒體功能障礙在CKD發(fā)生發(fā)展中的作用機制作一綜述。

1 Mic60概述

Mic60是一種由核基因編碼的線粒體蛋白，存在兩種亞型(88、90 kDa)。超分辨率顯微鏡顯示，Mic60錨定于線粒體內(nèi)膜，主要結(jié)構(gòu)域暴露在線粒體膜間隙，由一個N端跨膜結(jié)構(gòu)域和一個面向膜間空間的大型C端結(jié)構(gòu)域組成，其跨膜區(qū)域主要負責把蛋白質(zhì)錨定在內(nèi)膜上，而它的C端結(jié)構(gòu)域?qū)S持線粒體形態(tài)至關(guān)重要。這個位置不僅使其成為線粒體接觸位點和嵴組織系統(tǒng)(MICOS)復合體的一部分，還使其與位于線粒體外膜的分選和裝配機械(SAM復合體)的成員相互作用，形成線粒體膜間隙橋接復合體[6]。MICOS是線粒體內(nèi)膜上的一個大型多蛋白復合物，對維持線粒體嵴結(jié)構(gòu)、形成膜接觸位點和蛋白輸入至關(guān)重要，是線粒體結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)的核心樞紐[7]。Mic60作為MICOS復合物的核心組分，進化上高度保守，可直接或間接與其他組分相互作用。Mic60表達下調(diào)可導致MICOS其他組分不穩(wěn)定，MICOS復合物解體。線粒體嵴是線粒體內(nèi)膜向線粒體基質(zhì)折褶形成的一種重要結(jié)構(gòu)，不僅增大了線粒體內(nèi)膜面積，還富集多種線粒體功能蛋白，比如ATP合成酶、細胞色素C等重要蛋白，是細胞有氧呼吸的重要場所[8]。Mic60的丟失可導致線粒體嵴結(jié)構(gòu)的重組，Mic60缺陷細胞中的線粒體嵴紊亂，表現(xiàn)出同心環(huán)狀或輪狀結(jié)構(gòu)，取代正常的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)[9]，這也是Mic60表達異常的各種細胞和動物模型中的一種效應(yīng)。

2 Mic60介導線粒體功能障礙在CKD發(fā)生發(fā)展中的作用機制

2.1 參與線粒體呼吸功能障礙 Mic60不僅是維持線粒體結(jié)構(gòu)的核心蛋白，其在線粒體的功能調(diào)節(jié)上也起著至關(guān)重要的作用。Mic60的缺失對細胞生存能力產(chǎn)生不利影響，可能涉及線粒體嵴重排、線粒體呼吸受損、體內(nèi)平衡受損、裂變和融合受損以及與Mic60缺乏相關(guān)的蛋白輸入中斷等線粒體損傷效應(yīng)[10]。這些效應(yīng)似乎與線粒體膜結(jié)構(gòu)和MICOS的重組有關(guān)。除呼吸缺陷和動力學功能障礙外，Mic60的缺失也與線粒體相關(guān)的凋亡和自噬有關(guān)，不僅通過調(diào)節(jié)凋亡誘導因子及抗凋亡因子，控制細胞凋亡過程，還可招募泛素連接酶Parkin到受損線粒體，引發(fā)線粒體自噬。此外Mic60的抑制會影響線粒體DNA(mtDNA)的穩(wěn)定性，導致異常的類核形成、mtDNA損傷的積累和mtDNA轉(zhuǎn)錄的減弱，并可能進一步損害線粒體功能。Mic60的以上功能與CKD相關(guān)，Mic60介導的線粒體呼吸功能障礙、動力學紊亂以及線粒體相關(guān)凋亡、自噬是CKD發(fā)病的主要驅(qū)動因素。

ATP耗竭和活性氧(ROS)合成增多是CKD的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。生理情況下，分布于線粒體嵴上的五個酶復合物(Ⅰ～Ⅴ)組成的氧化呼吸鏈，通過氧化磷酸化(OXPHOS)作用形成ATP，而在此過程中，呼吸鏈上的電子脫漏可使得部分氧轉(zhuǎn)化成ROS。ROS是重要的第二信使，低濃度的ROS存在是正常現(xiàn)象；然而，過多的ROS生成會損傷mtDNA，導致電子傳遞鏈功能受損、ATP合成減少、線粒體外膜通透性增高，細胞色素C釋放，誘發(fā)細胞凋亡。腎臟是高度需要能量的器官，當能量產(chǎn)生耗竭或者ROS產(chǎn)生過量時，則會誘導氧化應(yīng)激，促進細胞凋亡、炎癥、纖維化等病理生理過程，直接與CKD的啟動和發(fā)展過程相關(guān)。線粒體嵴是線粒體產(chǎn)生ATP的主要場所，而線粒體嵴結(jié)構(gòu)的維持需要Mic60的參與[12]。此外，呼吸復合物的組裝也已被證實與Mic60參與組成的MICOS有關(guān)，因此猜測Mic60與線粒體呼吸功能存在某種聯(lián)系。John等[13]已經(jīng)將Mic60描述為維持線粒體嵴結(jié)構(gòu)和線粒體呼吸的關(guān)鍵蛋白，認為細胞中Mic60表達的缺失或下調(diào)，導致同心分層的嵴結(jié)構(gòu)，緊密包裹的膜層和內(nèi)隔室可能阻礙離子和代謝物的交換，進而導致膜電位和ROS的生成增加，氧化磷酸化功能缺陷。由于氧化磷酸化的缺陷，增加的代謝產(chǎn)物不能產(chǎn)生相應(yīng)的ATP產(chǎn)物。近年來，Yang等[14]發(fā)現(xiàn)，抑制Mic60可通過影響mtDNA的轉(zhuǎn)錄，導致線粒體OXPHOS復合物酶活性降低，最終影響電子傳遞鏈，導致呼吸功能障礙。在Mic60敲低的HeLa細胞中，由mtDNA編碼的OXPHOS復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ活性下調(diào)，而由核編碼的酶復合物活性無明顯變化，因此證明Mic60表達下調(diào)所致的OXPHOS酶活性下降，至少部分是由mtDNA轉(zhuǎn)錄水平降低引起。Suzuki等[15]報道了一種新合成的吲哚衍生物，即有絲分裂酸5(MA-5)，其可增加線粒體疾病患者的細胞ATP水平和成纖維細胞的存活率。值得注意的是，MA-5可以獨立于氧化磷酸化和電子傳遞鏈調(diào)節(jié)線粒體ATP的合成。此外，進一步研究MA-5在CKD中的作用機制，對缺血-再灌注損傷和順鉑通過直接靶向Mic60的腎病模型給予MA-5可顯著減少蛋白尿，改善腎功能。另外的檢測顯示，MA-5以內(nèi)膜嵴交界處的線粒體蛋白Mic60為靶標，過表達的Mic60增加了基礎(chǔ)的ATP水平，而用MA-5處理則放大了這種效應(yīng)。這種在不影響線粒體呼吸鏈活動下導致線粒體ATP的產(chǎn)生增加和ROS減少的MA-5-Mic60效應(yīng)，使人們對線粒體功能障礙相關(guān)的CKD治療不再局限于傳統(tǒng)的抗氧化治療。

2.2 參與線粒體動力學紊亂 線粒體是高度可塑的細胞器，可通過融合和裂變過程不斷改變其形狀和大小，這一過程統(tǒng)稱為線粒體動力學。線粒體融合包括線粒體外膜(OMM)和內(nèi)膜(IMM)的融合，主要由線粒體融合蛋白1(Mfn1)、線粒體融合蛋白2(Mfn2)和視神經(jīng)萎縮因子1(OPA1)調(diào)控，位于線粒體外膜上的線粒體分裂蛋白1和下游裂變蛋白1負責線粒體分裂。生理狀態(tài)下，線粒體的分裂和融合處于動態(tài)平衡，這種動態(tài)平衡不僅可以修復線粒體的結(jié)構(gòu)，還可以維持線粒體DNA的遺傳完整性，保證細胞的能量代謝；在細胞損傷或應(yīng)激過程中，細胞動力學發(fā)生改變，導致線粒體斷裂、外膜通透性增強和內(nèi)膜嵴重塑、導致凋亡因子釋放和細胞死亡。Lee等[16]發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠腎小管細胞凋亡和高糖誘導的人腎小管上皮細胞凋亡過程中，線粒體出現(xiàn)明顯的斷裂和嵴重塑，碎片化增加。Zhan等[17]研究也證明了線粒體斷裂是糖尿病腎病腎小管損傷的重要病理特征，同時，在缺血性和順鉑誘導的腎病模型中，阻斷線粒體斷裂具有腎保護作用。上述研究表明，線粒體過度分裂和融合受阻導致的線粒體斷裂與CKD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。線粒體動力學的穩(wěn)定需要多種蛋白質(zhì)和介質(zhì)的調(diào)控，除了上述提及的直接介導線粒體融合和分裂的關(guān)鍵蛋白。Mic60作為連接線粒體內(nèi)外膜的橋接蛋白，近年來被認為是一種新的線粒體動力學調(diào)節(jié)器[18]，哺乳動物細胞系中Mic60不僅影響多種裂變和融合蛋白水平以及相應(yīng)的裂變和融合率，Mic60還與OPA1相互作用，調(diào)節(jié)線粒體之間的內(nèi)膜融合，并參與嵴重塑[19]。有證據(jù)表明，Mic60/MICOS復合物與OPA1的關(guān)系是調(diào)節(jié)兩個線粒體內(nèi)膜融合的關(guān)鍵。此外，Mic60的缺失還會影響線粒體分裂和生物發(fā)生的關(guān)鍵步驟——mtDNA類核形成和mtDNA轉(zhuǎn)錄。雖然目前沒有直接證據(jù)證明Mic60在CKD發(fā)生發(fā)展過程中通過調(diào)節(jié)線粒體動力學功能發(fā)揮作用，但在其他系統(tǒng)比如神經(jīng)系統(tǒng)帕金森病的發(fā)病中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了線粒體裂變-融合動力學與神經(jīng)元中Mic60豐度之間的關(guān)系，證明了Mic60的增加抑制了神經(jīng)元中線粒體的分裂[20]。

2.3 參與線粒體相關(guān)凋亡 線粒體凋亡途徑是細胞凋亡的主要途徑之一。線粒體損傷后向細胞質(zhì)釋放細胞色素C和凋亡誘導因子AIF，在Bax、Bid等凋亡因子和抗凋亡因子Bcl-2等參與下激活Caspase-9；Caspase-9將進一步裂解為Caspase-3，最終誘導細胞凋亡。線粒體凋亡通路在哺乳動物細胞中具有重要的功能。高度依賴能量的腎臟細胞對缺血、缺氧、炎癥和中毒等病理刺激敏感，很容易發(fā)生功能和結(jié)構(gòu)損傷，其中足細胞和腎小管上皮細胞的凋亡，是CKD重要的病理特征，也是其發(fā)展為ESRD的關(guān)鍵[21]。足細胞損傷和凋亡可導致蛋白尿的發(fā)生，并發(fā)生在許多最終進展為CKD的腎小球疾病中；具有代謝活性和增殖潛能的腎小管上皮細胞在多種致病因素的作用下，也易發(fā)生損傷，促使線粒體向細胞質(zhì)釋放細胞色素C，誘導腎小管上皮細胞凋亡，最終導致腎小管損傷和腎小管間質(zhì)纖維化，促進ESRD的發(fā)展。Madungwe等[22]發(fā)現(xiàn)，Mic60表達下調(diào)通過凋亡誘導因子(AIF)-腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)-dependent機制和細胞周期阻滯誘導細胞凋亡，該機制涉及促凋亡的線粒體因子，如AIF、PARP。AIF是一種核編碼蛋白，成熟的AIF在線粒體定位于線粒體內(nèi)膜。當AIF位于線粒體內(nèi)時，具有延長細胞生存時間的作用，而從線粒體易位到細胞核時，可誘導染色體凝集和DNA斷裂，激活Caspase無關(guān)的細胞死亡信號。PARP1是參與DNA修復和程序性細胞死亡等多種細胞過程的蛋白質(zhì)家族成員[23]，其線粒體定位是由Mic60的存在和豐富程度來調(diào)節(jié)，當DNA損傷輕微時，聚腺苷二磷酸核糖反應(yīng)機制修復損傷。然而，當DNA損傷廣泛時，PARP耗盡細胞的NAD+和ATP，細胞無法修復。Mic60表達水平的降低導致線粒體腫脹和嵴損傷，這一效應(yīng)與ROS生成和誘導的鈣蛋白酶活性增加有關(guān)，也與細胞內(nèi)ATP生成和線粒體膜電位的顯著降低有關(guān)?？傊贸齅ic60可增加鈣蛋白酶活性，線粒體結(jié)構(gòu)降解，導致線粒體功能的關(guān)鍵性降低，而線粒體功能失調(diào)是通過AIF-PARP機制和核碎裂導致細胞凋亡增加的原因。Chen等[24]發(fā)現(xiàn)TNF受體相關(guān)蛋白(Trap1)，是一種定位與線粒體的分子伴侶蛋白，在細胞凋亡和腎小管間質(zhì)纖維化中起重要作用，在單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎病模型中，Trap1可以通過維持Mic60的表達，保護腎小管上皮細胞的線粒體結(jié)構(gòu)和功能，產(chǎn)生抗凋亡和抗纖維化的作用。上述兩個研究表明，Mic60的豐度與細胞凋亡的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

2.4 參與線粒體自噬 線粒體自噬是一種針對線粒體降解的巨噬細胞自噬，它能清除受損的線粒體，回收并重新分配有用的成分，在線粒體質(zhì)量控制和損傷后修復中起重要作用。其中線粒體激酶誘導的推定激酶(Pink1)/泛素連接酶(Parkin)信號通路介導的線粒體自噬是清除受損線粒體的主要通路[25]。線粒體分裂引發(fā)線粒體自噬，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的打開和線粒體膜電位的下降觸發(fā)線粒體自噬。隨后，Pink1選擇性地招募Parkin到受損的線粒體，泛素化OMM蛋白，如Mfn1、Mfn2和電壓依賴性陰離子通道，這些通道依次與p62、sequestosome 1和Ambra 1相互作用，參與招募自噬體膜和新的吞噬體。線粒體自噬具有促進細胞分化和延緩衰老等生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病小鼠中，線粒體自噬顯著減少，使用線?？寡趸瘎┛赏ㄟ^增加Pink1介導線粒體自噬進行線粒體質(zhì)量控制，改善糖尿病腎病腎小管損傷[26]。蛋白過載的腎小管上皮細胞損傷中，線粒體功能紊亂，激活Pink1/Parkin信號通路及其介導的線粒體自噬，以此清除受損線粒體，改善線粒體功能，使用Parkin小干擾RNA(siRNA)則減少上述保護機制。在5/6腎切除模型中，由于腎臟高灌壓，線粒體體積增大和分裂水平降低，線粒體自噬減少[27]，因此，CKD的線粒體自噬水平以降低為主，激活線粒體自噬可改善線粒體和腎臟細胞功能。Akabane等[28]發(fā)現(xiàn)，Mic60是腺苷酸環(huán)化酶激動劑或表達蛋白激酶A(PKA)的底物，其Ser528殘基經(jīng)歷了PKA依賴的磷酸化后，無法與PINK1產(chǎn)生瞬時相互作用，導致PINK1減少和Parkin定位錯誤，而缺乏磷酸化的Mic60突變體促進了Parkin的線粒體定位，這證明了PKA介導的Mic60磷酸化可負調(diào)控PINK1和Parkin啟動的線粒體清除。

Mic60作為MICOS的核心蛋白，其在維持線粒體功能上起著重要的調(diào)控作用。有關(guān)Mic60介導的線粒體相關(guān)疾病研究已廣泛開展[29]，但Mic60在CKD中確切的作用和機制尚未可知。鑒于Mic60在線粒體功能中的重要調(diào)節(jié)作用，以及線粒體穩(wěn)態(tài)失衡與CKD發(fā)生間明確的因果關(guān)系，從Mic60介導線粒體功能紊亂角度深入研究，有望為CKD干預發(fā)掘新的靶點。