苦參有效部位對(duì)人參黑斑病菌的抑菌研究

王彩云 陸承雙 常豐華

摘 要 采用超聲波提取工藝獲取苦參總生物堿，用藥物二倍稀釋法與菌落抑制率公式觀察計(jì)算苦參總生物堿對(duì)人參黑斑病菌的抑菌作用，并測(cè)定用藥時(shí)的抑菌濃度范圍;同時(shí)采用孢子萌發(fā)法和生長(zhǎng)速率法，對(duì)苦參中總黃酮提取物對(duì)人參黑斑病菌的抑制效果進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同苦參總生物堿濃度對(duì)人參黑斑病菌絲和孢子均具有抑制作用，在苦參總生物堿濃度為10 mg·mL-1及以上時(shí)與空白對(duì)照組相比，對(duì)人參黑斑病菌絲的抑制率為98.8%，孢子的抑制率為100%。苦參總黃酮溶液含量達(dá)到0.1 g·mL-1（10%）時(shí)，抑菌效果最佳。

關(guān)鍵詞 苦參;總生物堿;總黃酮;人參黑斑病

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.29.076

苦參為豆科植物苦參（Sophora flavescens Ait.）的干燥根，味極苦。其主要藥用成分為苦參堿和氧化苦參堿[1]，其重要化學(xué)成分還有黃酮類[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人參黑斑病菌從吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院人參種植基地患有黑斑病的人參葉片上培養(yǎng)分離取得。

培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（用于制藥敏瓊脂培養(yǎng)基，承接分離純化的黑斑病菌和盛放不同濃度的苦參總黃酮溶液）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超聲波提取機(jī)、鼓風(fēng)干燥箱、精密恒溫水浴鍋、醫(yī)用離心機(jī)、循環(huán)水式多用真空泵、密封型手提式粉碎機(jī)、萬(wàn)分之一電子天平、生物顯微鏡、冷藏柜、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、手提式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺(tái)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦參總生物堿的提取

取苦參根部，洗凈曬干，切片粉碎，稱取100 g粉末，苦參藥材粗粉以10倍量的0.2%鹽酸溶液進(jìn)行超聲波提取，控制提取條件為時(shí)間40 min，功率500 W[3-4]。提取液用紗布初過(guò)濾后，取得濾液，在離心轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1的離心機(jī)上離心5 min后，取得上清液，在上清液中加入3%的氫氧化鈉，調(diào)pH值為8.5[5]，靜置，析出沉淀，干燥備用。

1.2.2 苦參總黃酮提取及溶液的制備

用粉碎機(jī)將苦參飲片粉碎，得苦參細(xì)粉，并稱取50 g，用濾紙將其包好放置于索式提取器的提取管中，再向燒瓶中加入95%的乙醇溶液，通冷凝水，加熱回流，連續(xù)提取6 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)提取液進(jìn)行濃縮[6]，然后使用柱層析法對(duì)濃縮液中的總黃酮進(jìn)行分離[7]，得到較純的苦參總黃酮溶液，再使用95%的乙醇對(duì)分離得到的總黃酮溶液進(jìn)行定容，使溶液濃度為5 g·mL-1，最后將溶液分裝于10 mL具塞試管中，密封，置于4 ℃的冰箱內(nèi)保存，備用。

1.2.3 人參黑斑病菌的分離與培養(yǎng)

1）取高溫滅菌后的培養(yǎng)皿，在超凈工作臺(tái)中倒入已滅菌的PDA培養(yǎng)基20 mm，待冷凝后制作成平板，放入冷藏柜備用。

2）采集人參種植基地出現(xiàn)黑斑病病斑的人參葉片，用流水沖洗數(shù)遍。于無(wú)菌環(huán)境下，切下帶有人參黑斑病菌的病斑葉片數(shù)塊，并把病斑葉片放入70%乙醇溶液中消毒2～3 s，再放入0.1%的升汞溶液中消毒30 s，最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，并用滅菌后的吸水紙除去葉片上的水分，減少細(xì)菌滋生。將葉片置于PDA培養(yǎng)基平板上，每個(gè)PDA培養(yǎng)基平板放4～6塊，然后把培養(yǎng)皿倒置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中，在25 ℃下培養(yǎng)4～7 d。數(shù)日后觀察菌落生長(zhǎng)狀況，最后將分離純化的菌株保存于PDA斜面上，置4 ℃冰箱備用[8]。

1.2.4 采用二倍遞減稀釋法稀釋苦參總生物堿和總黃酮

苦參總生物堿分別配制成40 mg·mL-1、20 mg·mL-1、10 mg·mL-1、5 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、0.312 5 mg·mL-1、0.156 3 mg·mL-1共9個(gè)不同濃度的供試藥液。

苦參總黃酮溶液濃度分別為15%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%共6個(gè)不同濃度的供試藥液。

1.2.5 藥敏瓊脂培養(yǎng)基的制備

1.2.5.1含苦參總生物堿和總黃酮溶液的培養(yǎng)基制備

用移液槍分別吸取每個(gè)苦參總生物堿供試藥液濃度1 mL，加入已滅菌的培養(yǎng)皿中，再趁熱倒入已滅菌的PDA培養(yǎng)基20 mL，順時(shí)針輕搖晃，保證供試液與培養(yǎng)基混合均勻，制成含供試藥液的培養(yǎng)基[9]。每個(gè)濃度倒3皿，每皿約20 mL，9個(gè)濃度梯度，一個(gè)空白對(duì)照。并按照此方法對(duì)含苦參總黃酮溶液的培養(yǎng)基進(jìn)行制備。

1.2.5.2苦參總黃酮對(duì)照組和農(nóng)藥處理組PDA培養(yǎng)基的制備

按照如上方法分別向滅菌的PDA培養(yǎng)基中加入95%的乙醇溶液和濃度為1 200 mg·mL-1的代森錳鋅可濕性粉劑溶液各2 mL。

1.3 藥敏試驗(yàn)

1.3.1 各個(gè)濃度的供試藥液對(duì)黑斑病菌絲生長(zhǎng)影響

人參黑斑病菌培養(yǎng)7 d后，選擇均勻且長(zhǎng)勢(shì)好的菌落，用打孔器打出直徑8 mm的菌餅數(shù)個(gè)，分別置于空白組、含苦參總生物堿、含苦參總黃酮溶液、含代森錳鋅農(nóng)藥的供試藥液培養(yǎng)基平板的中心，各個(gè)濃度的供試藥液培養(yǎng)基和空白對(duì)照培養(yǎng)基每個(gè)3皿，每個(gè)培養(yǎng)基各放入一個(gè)菌餅。放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，并設(shè)定溫度為25 ℃，最后采用十字交叉法來(lái)測(cè)量菌落的直徑，各個(gè)濃度測(cè)量3次，求平均值，用以下公式計(jì)算抑制率[10]。

1.3.2 各個(gè)濃度供試藥液對(duì)黑斑病孢子萌發(fā)的影響

人參黑斑病原菌培養(yǎng)孢子7 d后，在超凈工作臺(tái)上選取生長(zhǎng)良好、活力強(qiáng)病菌孢子，用無(wú)菌水配成10倍視野下100～120個(gè)病菌孢子的菌懸液。菌懸液對(duì)供試藥液進(jìn)行稀釋，按計(jì)算好的400 μL中需加入不同濃度的供試藥液量，用菌懸液稀釋至400 μL并加入6孔凹板板孔中，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，計(jì)算孢子萌發(fā)率和抑制率[11]。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

本次抑菌實(shí)驗(yàn)每個(gè)濃度重復(fù)3組，空白對(duì)照一組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參總生物堿對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

苦參總生物堿各不同濃度對(duì)人參黑斑病菌絲的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出抑制作用，人參黑斑病菌在濃度為10 mg·mL-1及以上的總生物堿供試藥液培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)抑制率為98.8%。具體情況見(jiàn)表1。

2.2 苦參總生物堿對(duì)人參黑斑病菌孢子萌發(fā)的影響

苦參總生物堿不僅可以抑制人參黑斑病菌絲生長(zhǎng)，而且還對(duì)黑斑病病菌孢子的萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)總生物堿藥液濃度為10 mg·mL-1及以上時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率為100%，具體情況見(jiàn)表2。從表中可以看出，各個(gè)濃度總生物堿藥液對(duì)孢子萌發(fā)均有較好抑制效果，證明總生物堿藥液對(duì)人參黑斑病孢子的生長(zhǎng)有抑制作用。

2.3 苦參總黃酮對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同濃度苦參總黃酮溶液對(duì)人參黑斑病菌菌絲產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，濃度越高，抑菌率越高，濃度在10%時(shí)，苦參總黃酮溶液的抑菌率為81.3%，高于農(nóng)藥組，且呈顯著性差異，具體情況見(jiàn)表3。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)屬于人參葉片上黑斑病的室內(nèi)離體試驗(yàn)，利用苦參提取物總生物堿對(duì)PDA培養(yǎng)基里的黑斑病菌落進(jìn)行處理，觀察其菌落和孢子是否停止生長(zhǎng)或消失，從而檢測(cè)苦參總生物堿是否對(duì)人參黑斑病有抑菌作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，接菌后7 d，5 mg·mL苦參總生物堿藥液處理的菌絲抑制率達(dá)94.4%;5 mg·mL苦參總生物堿藥液濃度處理的孢子萌發(fā)抑制率為96.5%。在濃度為10 mg·mL及以上時(shí)與空白對(duì)照組相比，菌絲的抑制率為98.8%，孢子的抑制率為100%?？鄥⒖傸S酮對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果表明，濃度為10%及以上的苦參總黃酮溶液對(duì)人參黑斑病菌的抑菌效果最佳。本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，苦參總生物堿及總黃酮對(duì)人參黑斑病菌絲生長(zhǎng)有抑制效果，苦參總生物堿對(duì)人參黑斑病孢子萌發(fā)也有一定抑制效果，這為研發(fā)新型植物源農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)，可降低了農(nóng)藥大量使用對(duì)環(huán)境造成的污染。

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（責(zé)任編輯：趙中正）