微衛(wèi)星DNA標記評估湛江光裸星蟲養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性

姚澤彬 姚維 彭錦勝 王慶恒 郭昱嵩

摘? ?要? ?為評估湛江地區(qū)光裸星蟲養(yǎng)殖群體的種質(zhì)現(xiàn)狀，利用11對熒光標記微衛(wèi)星引物對光裸星蟲的1個野生群體和2個養(yǎng)殖群體，每個群體取30～31個樣本進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，11 個微衛(wèi)星位點在不同群體呈現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性，野生群體和2個養(yǎng)殖群體的平均等位基因數(shù)（Na）在4.182～4.636，平均有效等位基因數(shù)（Ne）在2.447～2.632，平均觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）分別在0.442～0.471、0.525～0.536，平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.461～0.475。Hardy-Weinber 平衡分析顯示，3 個群體的大部分位點未偏離平衡。在每個群體中進行連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)有4對位點間顯著（P<0.05）或者極顯著（P<0.01）偏離連鎖平衡。分子方差分析（AMOVA）顯示，光裸星蟲大部分的變異來自于群體內(nèi)而非群體間。綜合分析認為，本研究采集的2個光裸星蟲養(yǎng)殖群體遺傳多樣性豐富，暫未出現(xiàn)近交衰退現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞? ?光裸星蟲;遺傳多樣性;微衛(wèi)星標記

中圖分類號：S932? ?文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.31.001

光裸星蟲（Sipunculus nudus L.，1766），隸屬于方格星蟲綱（Sipunculidea）方格星蟲目（Sipunculiformes）方格星蟲科（Sipunculidae）方格星蟲屬（Sipunculus），俗稱“沙蟲”，生長于溫帶及熱帶水域的潮間帶，以沙粒間的底棲藻類、有機碎屑等為食，在中國沿海均有分布。光裸星蟲營養(yǎng)成分豐富，味道鮮美，高蛋白、低脂肪，具有較高的食用價值[1]，但自然采捕難度大，且過度采捕、海區(qū)污染、灘涂破壞等威脅光裸星蟲的種質(zhì)資源[2]，自然采捕已經(jīng)難以滿足市場的長期需求。近年，光裸星蟲的人工養(yǎng)殖日益成熟[3-7]，然而，養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展常會因無序引種、苗種異地交易等導致種質(zhì)資源混雜，進而影響遺傳多樣性的長期穩(wěn)定。因此，有必要對人工養(yǎng)殖光裸星蟲的遺傳多樣性進行監(jiān)測和評估。

光裸星蟲的遺傳多樣性研究目前主要集中在對分子標記和線粒體DNA的應用上，王慶恒等運用RAPD技術(shù)對4個光裸星蟲地理群體的遺傳多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)不同地理群體存在較大的遺傳分化[8]。郭昱嵩等利用微衛(wèi)星DNA分子標記分析了北部灣3個光裸星蟲地理群體的遺傳多樣性，得出“群體間存在較大的基因流、已產(chǎn)生較低水平的遺傳分化”的結(jié)論[9]。Du等利用線粒體COⅠ序列分析了3個地理野生群體的遺傳多樣性差異，認為光裸星蟲目前具有較高的遺傳多樣性和獨特的種群結(jié)構(gòu)[10]。彭銀輝等基于線粒體控制區(qū)序列開展了6個地理野生群體光裸方格星蟲的遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)遺傳分化在群體間并不顯著，光裸方格星蟲具有較高的遺傳多樣性，且不同地理群體存在頻繁的基因交流[11]。周于娜等利用線粒體控制區(qū)序列分析了光裸星蟲不同地理野生群體和不同地理養(yǎng)殖群體的遺傳差異情況，認為養(yǎng)殖群體光裸星蟲的遺傳多樣性略低于野生群體，養(yǎng)殖群體正在逐漸積累遺傳變異[12]。

微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），又稱簡單序列重復（SSR，simple sequence repeat），是1～6個堿基串聯(lián)重復序列。SSR標記具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、引物通用性較好和共顯性遺傳等特點，是研究群體遺傳學的常用手段。目前，運用微衛(wèi)星標記研究光裸星蟲遺傳多樣性的報道較少。

本研究運用科研團隊自主開發(fā)的SSR標記，篩選出多態(tài)性高的標記對光裸星蟲3個群體的遺傳多樣性進行檢測，并以野生群體作為參考群體來評估養(yǎng)殖光裸星蟲的遺傳多樣性，從而為光裸星蟲種質(zhì)資源保護和合理利用提供參考依據(jù)，還可為養(yǎng)殖光裸星蟲的種苗優(yōu)劣評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及DNA提取

實驗用野生光裸星蟲采集自湛江遂溪縣下六鎮(zhèn)（遂溪野生群體，SX）的自然灘涂。2個湛江養(yǎng)殖群體分別采集自湛江碧海灣水產(chǎn)有限公司樂民繁育基地（樂民養(yǎng)殖群體，LM）和廣東海洋大學覃斗（覃斗養(yǎng)殖群體，TD）試驗基地。參照文獻[13]的苯酚/氯仿抽提法，稍作修改后用于提取光裸星蟲基因組DNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用凝膠成像儀進行觀察，估算DNA的濃度和純度。

1.2 微衛(wèi)星序列的引物篩選

本實驗中項目組自主開發(fā)20對光裸星蟲微衛(wèi)星引物[14]，委托上海生工生物工程有限公司合成。將合成好的微衛(wèi)星引物進行群體初篩選，篩選實驗用20個隨機個體，提取DNA后對所有引物進行預擴增，根據(jù)預擴增的結(jié)果篩選出11對多態(tài)性引物（見表1）。預擴增體系與程序如下：PCR預擴增總體系為10 μL，包含DNA模板0.5 μL，上下游引物（5 μmol·L-1）各0.5 μL，PCR Mix 5 μL，剩余體積用ddH2O 補齊至10 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性80 s;94 ℃

30 s，退火（溫度依據(jù)引物而定）30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，銀染顯色，以出現(xiàn)清晰主帶為標準，篩選出多態(tài)性引物和每對引物最適退火溫度，等位基因大小以 20 bp DNA Ladder Marker為參照標準進行判讀。

1.3 PCR擴增及微衛(wèi)星檢測

委托上海生工生物工程有限公司合成熒光引物，用于光裸星蟲3個群體樣本的擴增，每個群體30～32個個體。

PCR擴增體系為25 μL，包含DNA模板2 μL，上下游引物（5 μmol·L-1）各1 μL，Taq酶0.125 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+） 2.5 μL，dNTPs （2.2 mmol·L-1） 2 μL，剩余體積用ddH2O 補齊至25 μL。每個微衛(wèi)星標記隨機抽取4個PCR產(chǎn)物進行檢測，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，然后放入凝膠成像儀中觀察，檢測PCR產(chǎn)物是否正常。將檢測到無異常的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進行毛細管電泳檢測，檢測儀器為3730XL序列分析儀（ABI公司，美國）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用GenAlEx 6.503軟件對生物公司反饋的基因片段長度等數(shù)據(jù)進行遺傳分析，計算11個位點的有效等位基因數(shù)（Ne）、等位基因數(shù)（Na） 、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）、Hardy-Weinberg平衡檢驗、固定指數(shù)（Fis）、群體間遺傳距離（DA）、遺傳相似系數(shù)（I）和分子方差分析（AMOVA）。利用PIC-CAL0.6軟件計算每個微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量（PIC）。利用PopGen32軟件對每個群體的連鎖不平衡進行檢測。無效等位基因用Micro-checker軟件進行分析。群體間基于Nei's遺傳距離的聚類樹使用MEGA-X軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星引物的篩選

篩選實驗結(jié)果顯示，微衛(wèi)星多態(tài)位點有11個，其余9個為單態(tài)位點。所篩選出來的11對多態(tài)性引物的特征見表1。

2.2 等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)

3個光裸星蟲群體的11個微衛(wèi)星標記均表現(xiàn)出多態(tài)性，由表2可知，3個群體中，遂溪野生群體的平均Na和平均Ne均最低，為4.182個和2.447個;樂民養(yǎng)殖群體的平均Na最高，為4.636個;覃斗養(yǎng)殖群體的平均Ne最高，為2.632個。

2.3 遺傳雜合度、Hardy-Weinberg平衡與連鎖不平衡

表2數(shù)據(jù)顯示，3個群體的平均觀測雜合度Ho和期望雜合度He的范圍分別在0.442～0.471和0.525～0.536，其中，平均Ho遂溪野生群體最大，為0.471，樂民養(yǎng)殖群體最小，為0.442;覃斗養(yǎng)殖群體的平均He在3個群體中最大，為0.536，另外2個群體的平均He均為0.525。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗，在3個群體11個多態(tài)微衛(wèi)星位點中大部分未偏離平衡狀態(tài)（P>0.05），每個群體均有4個位點偏離平衡狀態(tài)（P<0.05），其中Snu06、Snu07和Snu20位點在3個群體中均偏離平衡，Snu05位點在2個養(yǎng)殖群體偏離平衡狀態(tài)，Snu19位點在野生群體偏離平衡。在每個群體中進行連鎖不平衡分析，結(jié)果表明4對位點間顯著（P<0.05）或者極顯著（P<0.01）偏離連鎖平衡;在樂民養(yǎng)殖群體中有2對連鎖不平衡（Snu05/Snu19、Snu07/Snu13），野生群體和覃斗養(yǎng)殖群體均只出現(xiàn)1對相同的連鎖不平衡（Snu7/Snu19）。

2.4 多態(tài)信息含量（PIC）與無效等位基因

3個群體11個微衛(wèi)星位點的平均PIC在0.461～0.475，遂溪野生群體最小，2個養(yǎng)殖群體相對較大。Micro-checker檢測發(fā)現(xiàn)，Snu07、Snu19和Snu20位點在3個群體中均存在無效等位基因，Snu05位點在2個養(yǎng)殖群體中存在無效等位基因，其余位點在各個群體中均不存在無效等位基因。

2.5 群體間遺傳分化分析

利用GenAlEx 6.503軟件計算得到了3個群體間的Nei遺傳距離（DA）和遺傳相似系數(shù)（I）（見表3）。樂民養(yǎng)殖群體和覃斗養(yǎng)殖群體間的DA最大，I最小;遂溪野生群體和覃斗養(yǎng)殖群體間的DA最小，I最大。3個群體間的DA為0.020～0.034。根據(jù)Nei遺傳距離采用鄰接法和UPGMA 法對3個群體進行聚類分析，結(jié)果顯示遂溪野生群體和樂民養(yǎng)殖群體聚為一支，覃斗養(yǎng)殖群體為一支（見圖1，僅列出鄰接圖）。

種群的遺傳分化系數(shù)（Fst）表明種群遺傳分化的水平，F(xiàn)st在0～0.05表明種群遺傳分化很弱，F(xiàn)st在0.05～0.15表明種群遺傳分化處于中等水平，F(xiàn)st在0.15～0.25表明種群遺傳分化較大，F(xiàn)st大于0.25表明種群遺傳分化很大。本研究中方格星蟲3個群體的Fst在0.008～0.012，均不顯著。AMOVA分析表明，99%的遺傳變異源于群體內(nèi)，群體間的遺傳變異僅占1%（見表4）。

3 討論

遺傳雜合度（H）是指微衛(wèi)星位點為雜合子的比例，可反映各群體在多個位點上的遺傳變異，是描述群體遺傳變異的一個重要指標。群體H高，表明該群體的遺傳變異多，群體遺傳多樣性高[15]。郭昱嵩等在2012年報道了北部灣三個光裸星蟲野生群體的遺傳多樣性[9]，我們用與該研究相同的11個多態(tài)性位點對其平均雜合度進行矯正，得到湛江烏石群體的平均Ho、平均He分別為0.458、0.500，北海山口群體的平均Ho、平均He分別為0.471、0.484，越南錦普群體的平均Ho、平均He分別為0.484、0.532。矯正后的數(shù)據(jù)，本研究遂溪野生群體的平均Ho和平均He略高于郭昱嵩等報道的湛江烏石野生群體，2個養(yǎng)殖群體的平均Ho和平均He除了樂民群體的平均Ho低于烏石群體外，其他均略高于烏石群體，但差異很小，這表明光裸星蟲遂溪群體的遺傳變異程度目前仍處于較高水平。

多態(tài)信息含量（PIC）反映了微衛(wèi)星標記所包含的遺傳信息含量。在一個群體中該雜合子的比例越大，PIC值越大，該雜合子提供的遺傳信息越多。根據(jù)Botstein等[16]提出的標準，本研究的11個多態(tài)性位點中有4個高度多態(tài)性位點（PIC>0.5）、6個中度多態(tài)性位點（0.25

遺傳距離（DA）的大小可以用來確定群體之間的親緣關(guān)系，群體間的DA與親緣關(guān)系呈正比，與遺傳相似度（I）呈反比。DA越大，表明群體間的親緣關(guān)系越遠，I越小;反之亦然[17]。本研究采用11個微衛(wèi)星位點對3個光裸星蟲群體進行遺傳多樣性分析，根據(jù)Nei's指數(shù)法對光裸星蟲3個群體的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果顯示遂溪野生群體和覃斗養(yǎng)殖群體之間的I最大（0.980）、DA最?。?.020），鄰接法和UPGMA法聚類分析為一支。遺傳分化指數(shù)（Fst）是指群體內(nèi)的變異位點在群體位點中所占的比值，比值越大，群體遺傳分化程度越高，本研究中光裸星蟲3個群體間的Fst值在0.008～0.012，均小于0.05，3個群體均分化較小[18]，這可能與養(yǎng)殖群體為遂溪野生群體繁育的后代有關(guān)。AMOVA分析表明，群體間的變異僅1%，提示群體內(nèi)的遺傳變異是引起種群總體變異的主要因素。這與光裸星蟲海球幼體時期浮游生活相吻合，因為這增加了群體間的基因交流，導致群體間的變異程度遠不如群體內(nèi)部。總的來說，光裸星蟲養(yǎng)殖群體和野生群體之間分化很小，養(yǎng)殖群體暫未出現(xiàn)明顯的退化，這與周于娜等[12]報道的結(jié)果相似。

整體而言，本研究篩選的11個微衛(wèi)星位點具有較高的多態(tài)性，適用于3個光裸星蟲群體的遺傳多樣性研究。研究結(jié)果表明遂溪野生群體與2個養(yǎng)殖群體的各項遺傳多樣性參數(shù)之間總體上差異不大，群體間分化水平較低，光裸星蟲養(yǎng)殖群體暫未出現(xiàn)明顯的退化現(xiàn)象，這與現(xiàn)階段光裸星蟲大群體親本育苗、沙蟲苗養(yǎng)殖群體沙灘放養(yǎng)等養(yǎng)殖模式吻合。但是，近年來海洋環(huán)境污染特別是海灘垃圾污染導致的灘涂破壞有加重趨勢[19-21]，加上人為無序引種、苗種異地交易等，可能會進一步導致光裸星蟲資源的遺傳多樣性水平下降，因此保護光裸星蟲種質(zhì)資源已經(jīng)刻不容緩。我們認為只有加強對海洋垃圾源頭的控制，定期檢測光裸星蟲資源的遺傳多樣性水平，同時推廣科學合理的養(yǎng)殖模式，才能保護好光裸星蟲資源，達到星蟲資源的可持續(xù)利用。

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（責任編輯：丁志祥）