EMSCs復(fù)合CPC支架體外生物相容性的研究

陳琛 許安平

摘要：目的 ?觀察磷酸鈣骨水泥（CPC）對(duì)鼻粘膜間充質(zhì)干細(xì)胞（EMSCs）體外誘導(dǎo)成骨的影響。方法 ?取出SD大鼠的全層鼻粘膜行體外培養(yǎng)并擴(kuò)增EMSCs，選取第三代生長(zhǎng)狀況良好的EMSCs與CPC混合培養(yǎng)，行成骨誘導(dǎo)14天。將EMSCs/CPC設(shè)定為CPC材料組，單純EMSCs培養(yǎng)為對(duì)照組。ALP檢測(cè)兩組EMSCs堿性磷酸酶活性，茜素紅染色法測(cè)定鈣結(jié)節(jié)面積大小，免疫印跡法檢測(cè)成骨誘導(dǎo)相關(guān)蛋白表達(dá)水平;鬼筆環(huán)肽染色法動(dòng)態(tài)觀察EMSCs在CPC表面的細(xì)胞形態(tài);MTT法檢測(cè)CPC對(duì)EMSCs增殖的影響，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 ?①CPC材料組較對(duì)照組中堿性磷酸酶活性在成骨誘導(dǎo)14 d后較高，染色程度深;茜素紅染色中CPC材料組的鈣結(jié)節(jié)更大;鬼筆環(huán)肽染色液染色第3天EMSCs形態(tài)呈圓形，細(xì)胞形態(tài)未完全伸展，第7天EMSCs呈長(zhǎng)梭型，第14天后EMSCs成堆生長(zhǎng);免疫印跡法檢測(cè)CPC材料組表達(dá)collagen I和osteocalcin高于對(duì)照組（P<0.05）;②細(xì)胞接種后，CPC材料組和對(duì)照組隨在前5 d內(nèi)保持正常的增殖速度，兩者之間無明顯差異，第7天開始可見明顯的促進(jìn)作用，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?CPC是一種優(yōu)良的組織工程支架材料，能夠促進(jìn)EMSCs體外增殖以及誘導(dǎo)成骨，EMSCs與CPC之間具有良好的生物相容性。

關(guān)鍵詞：EMSCs;CPC;生物相容性

中圖分類號(hào)：R318.08 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.23.020

文章編號(hào)：1006-1959（2020）23-0068-05

Abstract：Objective ?To observe the effect of calcium phosphate cement （CPC） on the induction of osteogenesis of nasal mucosal mesenchymal stem cells （EMSCs） in vitro.Methods ?The full-thickness nasal mucosa of SD rats was taken out and cultured in vitro and expanded EMSCs. The third-generation EMSCs with good growth condition were mixed and cultured with CPC， and osteogenic induction was performed for 14 d. Set EMSCs/CPC as the CPC material group， and cultivate pure EMSCs as the control group. ALP was used to detect the alkaline phosphatase activity of the two groups of EMSCs， the alizarin red staining method was used to determine the size of calcium nodules， the Western blotting method was used to detect the expression level of osteoinduction-related proteins; the phalloidin staining method was used to dynamically observe the cell morphology of EMSCs on the CPC surface; MTT method was used to detect the impact of CPC on the proliferation of EMSCs and perform statistical analysis.Results ?①The alkaline phosphatase activity in the CPC material group was higher than that in the control group after 14 d of osteogenic induction， and the staining degree was deeper;In Alizarin Red staining， the calcium nodules in the CPC material group were larger; on the third day of staining with phalloidin staining， the EMSCs were round in shape and the cell morphology was not fully extended. On the 7th day， the EMSCs were in a long spindle shape， and after the 14th day，growth in piles; the expression of collagen I and osteocalcin in the CPC material group detected by western blotting was higher than that of the control group （P<0.05）; ②After cell inoculation， the CPC material group and control group maintained normal proliferation rates within the first 5 d. There was no significant difference between the patients， and the obvious promotion effect was seen on the 7th day，the difference between the two groups was statistically significant（P<0.05）.Conclusion ?CPC is an excellent scaffold material for tissue engineering， which can promote the proliferation of EMSCs and induce bone formation in vitro. There is good biocompatibility between EMSCs and CPC.

Key words：EMSCs;CPC;Biocompatibility

骨缺損（bone defect）的治療是臨床常見的難題，骨移植術(shù)是目前臨床治療骨缺損的重要方法之一，但各種骨移植術(shù)都有一定的局限性。通常都會(huì)因?yàn)槿」橇坑邢?，需進(jìn)行二次手術(shù)，對(duì)患者機(jī)體損傷較大，發(fā)生免疫反應(yīng)等因素影響治療效果[1，2]。磷酸鈣骨水泥（calciumphosphate cement，CPC）具有良好的生物相容性以及骨誘導(dǎo)性，是臨床常見的植骨材料[3]。外胚間充質(zhì)干細(xì)胞（ectomesenchymal stem cells，EMSCs）是一種具有多向分化的潛能的特殊類型干細(xì)胞[4]。因其取材量大、手術(shù)操作方便、損傷小，是骨組織工程良好的種子細(xì)胞[5]。本課題組既往研究表明EMSCs在特定的條件下可以被誘導(dǎo)成骨，并可高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白[6]?；诖耍狙芯客ㄟ^體外培養(yǎng)EMSCs，復(fù)合CPC培養(yǎng)，探討CPC與EMSCs的生物相容性和EMSC成骨細(xì)胞分化的水平，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器 ?6周齡健康雄性SD大鼠（體質(zhì)量約150 g）購(gòu)于江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（動(dòng)物使用許可證：SCXK蘇2002-0045）;CPC（購(gòu)自英國(guó)施樂輝公司）;胎牛血清（Gibco，USA）、0.25 %胰酶（Sigma）;DMEM/F12購(gòu)于hyclone通用公司（美國(guó)）。二巰基乙醇購(gòu)于鼎國(guó)生物科技有限公司（北京）;羊抗兔collagen I和osteocalcin，羊抗鼠nestin和vimentin，山羊抗鼠-cy3 IgG，山羊抗兔-cy3 IgG，山羊抗兔IgG HRP，山羊抗鼠IgG HRP，購(gòu)于武漢博士德公司;鬼筆環(huán)肽購(gòu)于Sigma公司;堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于索來寶公司;多聚甲醛干粉購(gòu)于國(guó)藥有限公司;Triton-100購(gòu)于北京生物化學(xué)試劑公司。

1.2方法

1.2.1 CPC ?制備CPC按照產(chǎn)品規(guī)格說明進(jìn)行調(diào)拌混勻，平鋪于24孔培養(yǎng)板中，待其凝固，厚度約為0.5 mm。

1.2.2鼻粘膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、原代培養(yǎng)及傳代 ?SD大鼠頸椎脫位，無菌分離大鼠下鼻甲，置于4℃PBS中，去除鼻中隔軟骨，分離全層鼻粘膜;鼻粘膜取出后用無血清DMEM/F12漂洗3 次，然后用眼科剪充分剪碎，去除上清液，加入0.25% 胰酶37 ℃消化10 min，PBS漂洗3次，離心，去除胰酶，后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入4 ml 10% FBS 的DMEM/F12（含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml），置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）培養(yǎng)，每隔2 d半量換液，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底85%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取第3代EMSCs備用。

1.2.3 EMSCs表面標(biāo)志鑒定 ?待第3代EMSCs細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底的75%時(shí)，用4%多聚甲醛4℃固定8 h，PBS漂洗3次，每次10 min，洗去多余的多聚甲醛;然后2% BSA封閉30 min，0.1% Triton-100破膜30 min，PBS洗3遍，加入一抗：nestin和vimentin，4℃孵育12 h，漂洗一抗;然后加入山羊抗鼠二抗（cy3-IgG，1∶250），37 ℃孵育1 h，DAPI染核，甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 MTT法檢測(cè)EMSCs增殖活性 ?CPC材料組以0.25%胰酶消化生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代EMSCs制成的細(xì)胞懸液，5×109/L吸取100 μl分別滴加到已置入24孔板的CPC表面，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度放置2 h后，反轉(zhuǎn)材料，向該材料另一面滴加100 μl細(xì)胞懸液，行混合培養(yǎng)。分別于第1、3、5、7、14 d，用無血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗CPC支架，以去除未貼壁的細(xì)胞，并將EMSCs/CPC復(fù)合支架移入新的無菌培養(yǎng)板中，每孔加入0.01 mo1/L MTT 溶液100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，小心吸除培養(yǎng)液，每孔加入500 μl DMSO，振蕩10 min后，取200 μl溶解液轉(zhuǎn)入96 孔板中，選擇波長(zhǎng)490 nm，在酶聯(lián)免疫測(cè)試儀上測(cè)定OD值。以EMSCs直接接種于24孔板培養(yǎng)作為對(duì)照組。

1.2.5鬼筆環(huán)肽染色 ?配制0.01%的鬼筆環(huán)肽染色液，取種植于CPC表面第3、7、14天的EMSCs，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍，加入鬼筆環(huán)肽工作液，37℃作用30 min，甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察EMSCs形態(tài)。

1.2.6成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法 ?選取生長(zhǎng)狀況良好第3代EMSCs細(xì)胞分別接種在鋪有CPC的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底的85%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入足量的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、25 μg/L 抗壞血酸、15%FBS 及含有0.1 μmol/L地塞米松的DMEM），每7 d換液，對(duì)照組同樣方式處理，成骨細(xì)胞誘導(dǎo)14 d。

1.2.7堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè) ?ALP活性測(cè)定按照試劑盒說明書配制工作液，分別取成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7和14 d 的各組EMSCs，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，0.25%胰酶消化細(xì)胞，反復(fù)吹打培養(yǎng)板后加入等量含10%PBS的培養(yǎng)基終止消化，取出培養(yǎng)板，培養(yǎng)液離心，制懸。加入ALP工作液，37 ℃作用1 h，甘油封片后于顯微鏡下觀察。

1.2.8鈣結(jié)節(jié)染色 ?配制0.3%的茜素紅染液;成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7和14 d 的各組細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，ddH2O小心漂洗3 次;干燥;加入適量的0.3%茜素紅染液，作用30 min;棄去染液;再次干燥;甘油封片后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞外鈣鹽沉積情況，采用Image-Proplus軟件計(jì)算形成鈣結(jié)節(jié)的面積。

1.2.9免疫印跡 ?取成骨誘導(dǎo)14 d的EMSCs，PBS洗3遍，每個(gè)孔中加入含有1%蛋白酶抑制劑的裂解液100 μl置于冰上1 h，后輕輕刮取置于EP 管中。在4℃下10000 r/min 離心10 min，吸取上清液煮沸后-20℃保存。加樣品于10% SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，350 mA 恒流轉(zhuǎn)膜90 min，PVDF用3% 脫脂奶粉封閉1 h。將膜分別與對(duì)應(yīng)的一抗collagen（1∶500）、osteocalcin（1∶500） 和β-tubulin 4℃孵育12 h，之后TBST 漂洗3次，10min /次。加入抗兔或抗鼠IgG-HRP（1∶5000），37℃孵育1 h，TBST 漂洗3次，10 min/次。用超敏形ECL發(fā)光液顯示陽(yáng)性條帶，在Typhoon系統(tǒng)上掃描結(jié)果，Image J軟件分析灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 EMSCs的形態(tài)學(xué)和表面標(biāo)志鑒定 ?組織培養(yǎng)3 d后開始貼壁生長(zhǎng)，5 d后可見較多貼壁細(xì)胞，呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)均勻。純化后的細(xì)胞貼壁速度加快，增殖能力更強(qiáng)。免疫熒光結(jié)果顯示90%的EMSCs表達(dá)nestin和vimentin，提示獲得了較高純度的EMSCs，見圖1。

2.2 MTT法檢測(cè)兩組EMSCs增殖情況 ?細(xì)胞接種后，CPC材料組和對(duì)照組隨在前5 d內(nèi)保持正常的增殖速度，兩者之間無明顯差異，第7天開始可見明顯的促進(jìn)作用，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3鬼筆環(huán)肽染色 ?分別于第3、7、14天后用鬼筆環(huán)肽染色液染色結(jié)果顯示，第3天EMSCs形態(tài)呈圓形，細(xì)胞形態(tài)未完全伸展，第7天EMSCs呈長(zhǎng)梭型，第14天后EMSCs成堆生長(zhǎng)，見圖2。

2.4堿性磷酸酶染色 ?兩組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)第7、14天后行ALP染色，EMSCs堿性磷酸酶染色較深，ALP活性較強(qiáng)（第14天），見圖3。

2.5鈣結(jié)節(jié)染色 ?兩組EMSCs成骨誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色，兩組EMSCs形成的鈣結(jié)節(jié)面積大小無明顯差別;14天后CPC組形成鈣結(jié)節(jié)面積明顯大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2、圖4。

2.6免疫印跡結(jié)果 ?兩組EMSCs成骨誘導(dǎo)14 d，CPC材料組EMSCs表達(dá)Collagen I和osteocalcin高與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5。

3討論

臨床骨缺損的治療一直都是醫(yī)學(xué)上的難題，骨組織工程技術(shù)為解決這個(gè)問題提供了一種新的解決思路。理想的支架材料可以為種子細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)繁殖及分化的微環(huán)境[7]。CPC是一種應(yīng)用于臨床二十余年的植骨材料，具有良好的骨誘導(dǎo)性[8，9]。溫世鋒等[10]將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種在CPC表面，結(jié)果表面人間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在CPC表面附著增殖，并能向成骨細(xì)胞分化，證實(shí)了CPC的良好生物相容性。EMSCs是間充質(zhì)干細(xì)胞的特殊類型，主要存在于頭面部粘膜的固有層，具有多向分化的潛能。可以在體外定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等?？煞€(wěn)定傳代至15代并保持良好的干細(xì)胞特性[11，12]。因此，本課題組將EMSCs與CPC混合培養(yǎng)，體外誘導(dǎo)分化，研究EMSCs復(fù)合CPC支架材料體外的成骨誘導(dǎo)及生物相容性。

本研究中，通過鬼筆環(huán)肽染色法動(dòng)態(tài)觀察體外培養(yǎng)的EMSCs生長(zhǎng)情況，14 d后發(fā)現(xiàn)EMSCs開始成堆聚集，表明EMSCs/CPC具有良好生物相容性。MTT法是檢測(cè)對(duì)比活細(xì)胞數(shù)的比較敏感的方法之一[13]。實(shí)驗(yàn)的第7天可見CPC對(duì)EMSCs明顯的促進(jìn)用;EMSCs/CPC組中ALP活性更強(qiáng)，茜素紅染色形成的鈣結(jié)節(jié)更大，并具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明CPC可促進(jìn)EMSCs向成骨細(xì)胞分化。本課題組收取了成骨誘導(dǎo)14 d的兩組細(xì)胞蛋白，進(jìn)行免疫印跡，檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平;collagen I和osteocalcin成骨細(xì)胞是研究骨代謝的生化標(biāo)志物[14，15];免疫印跡數(shù)據(jù)顯示，EMSCs/CPC組表達(dá)collagen I和osteocalcin高于對(duì)照組（P<0.05），進(jìn)一步明確了CPC對(duì)EMSCs體外誘導(dǎo)成骨的促進(jìn)作用。

本研究結(jié)果證實(shí)了CPC對(duì)EMSCs的生長(zhǎng)繁殖，分化具有明顯的促進(jìn)用。CPC與EMSCs具有良好的生物相容性。然而，目前對(duì)于EMSCs/CPC復(fù)合支架的研究?jī)H限于體外實(shí)驗(yàn)，相較于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的影響因子多樣化，相關(guān)的數(shù)據(jù)及研究結(jié)果具有一定的局限性，還需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

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收稿日期：2020-08-25;修回日期：2020-09-10

編輯/肖婷婷