巖藻聚糖硫酸酯降解酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及酶學(xué)特性研究

劉淮德　徐文飛　王菲菲　王晶

摘要 [目的]從水環(huán)境中篩選高活性降解菌，從而將高分子多糖降解為低分子量、藥用價(jià)值更高的多糖。[方法]通過唯一碳源、富集培養(yǎng)等方法對淡水來源的細(xì)菌進(jìn)行篩選獲得活性較高的巖藻聚糖硫酸酯降解菌，然后根據(jù)菌株的形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA分析和進(jìn)化樹構(gòu)建進(jìn)行種屬鑒定，進(jìn)一步對降解菌粗酶液的熱穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度、最適pH和金屬離子對酶穩(wěn)定性影響進(jìn)行研究。[結(jié)果]篩選獲得了2株活性較高的巖藻聚糖硫酸酯降解菌JS3和JN3，這2株菌菌液酶活達(dá)384、410 U。菌株JS3和JN3歸屬于克雷白氏桿菌屬（Klebsiella sp.）。酶學(xué)分析表明，JS3和JN3菌株粗酶液在40～70 ℃具有比較好的熱穩(wěn)定性，在pH 4.0～7.0內(nèi)，該酶能保持良好的穩(wěn)定性。JS3和JN3粗酶液與底物反應(yīng)的最適溫度分別為45、40 ℃，最適pH均為5.0。金屬離子對酶的活性有一定影響，離子濃度為1×10-2 mol/L時(shí)，Mg2+、Ca2+、Zn2+對該酶有激活作用，Cu2+則強(qiáng)烈抑制酶活，Ni2+也在一定程度上抑制該酶活性。[結(jié)論]該研究發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)酶菌株可以用于巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的制備，為巖藻聚糖硫酸酯降解酶的制備和應(yīng)用提供依據(jù)和基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巖藻聚糖硫酸酯降解酶;降解菌;篩選;鑒定;酶學(xué)特性

中圖分類號 TS 254.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）23-0016-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.004

Isolation and Identification of a Fucoidanase-producing Freshwater Bacterium and Enzymatic Properties Research

LIU Huai-de，XU Wen-fei，WANG Fei-fei et al

（Nantong University，Nantong，Jiangsu 226019）

Abstract [Objective]In this paper，high activity degrading bacteria were screened from water environment to degrade high molecular weight polysaccharides into polysaccharides with low molecular weight and higher medicinal value.[Method]Two fucoidanase-producing freshwater bacterium which have high enzyme activity were isolated by the methods of sole carbon source and enrichment culture.Strains were identified by a variety of methods including the morphological and physiological characteristics，as well as 16S rDNA analysis.Furthermore，the effects of thermal stability，optimal reaction temperature，optimal pH and metal ions on the enzyme stability were studied.[Result]The enzyme activity of two strains JS3 and JN3 reached 384，410 U.They were identified to be Klebsiella sp..Fucoidanase producing Klebsiella sp.had not been reported from freshwater before.The results showed that the fucoidanases of those strains remained stable at 40-70 ℃ and efficiently degraded? at pH 4.0-7.0.The optimal reaction temperature of fucoidanases JS3 and JN3 were 45 ℃ and 40 ℃ respectively，while the most stable pH for both of the enzyme was 5.0.The presence of Mg2+，Ca2+ and Zn2+? activated the enzyme，however，Cu2+? had strongly inhibitory effects on the enzymatic activity.And Ni2+? can also inhibit the enzyme activity to a certain extent.[Conclusion]This study has laid a foundation for the further characterization of the enzyme and paved the way for the production of lower molecular weight fucoidan as well as fucoidan oligosaccharides in the future.

Key words Fucoidanase;Degrading bacterium;Isolation;Identification;Enzymatic characteristics

巖藻聚糖硫酸酯是一種獨(dú)特的活性多糖，具有抗凝血、降血壓、降血脂、治療慢性腎衰等多種生物活性[1]，但是由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、溶解性差、生物吸收利用度低等缺點(diǎn)限制了其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，對糖類藥物的研究逐漸從多糖轉(zhuǎn)到低聚糖和寡糖。近年來，低分子量巖藻聚糖硫酸酯的研究受到了廣泛的關(guān)注，Wang等[2]利用過氧化氫氧化降解方法制備得到分子量為6 000 Da的低分子量巖藻聚糖硫酸酯，其具有更好的抗氧化和治療慢性腎衰的活性。常用的多糖降解手段有化學(xué)法、酶法和物理方法[3]。傳統(tǒng)的化學(xué)水解法降解巖藻聚糖反應(yīng)條件劇烈，工藝條件難以控制，活性物質(zhì)易被破壞且產(chǎn)物不易控制。酶作為一種有催化活性的蛋白質(zhì)，具有催化效率高、底物專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物不易被破壞等優(yōu)點(diǎn)而逐步取代化學(xué)水解。巖藻聚糖硫酸酯降解酶有2種類型：①內(nèi)切型巖藻聚糖硫酸酯降解酶，可以斷裂巖藻聚糖核心處的糖苷鍵，導(dǎo)致分子量快速降低;②外切型巖藻聚糖硫酸酯降解酶，可以作用于糖鏈的端基，依次釋放一些單糖和寡糖，從而使分子量緩慢降低[4]。

目前對于巖藻聚糖硫酸酯降解酶來源的研究主要集中在海洋軟體動物和海洋細(xì)菌中，也有科學(xué)家從其他無脊椎動物中制備獲得了巖藻聚糖硫酸酯降解酶[5]。巖藻聚糖硫酸酯降解酶對底物有較強(qiáng)的依賴性，不同來源的巖藻聚糖硫酸酯降解酶只能降解一種或幾種特點(diǎn)結(jié)構(gòu)的巖藻聚糖。Silchenko等[6]從海洋細(xì)菌KMM 3553中分離出一種巖藻聚糖硫酸酯降解酶，他們發(fā)現(xiàn)這種巖藻聚糖硫酸酯降解酶可以催化水解來源于Fucus evanescens和Fucus vesiculosus的巖藻聚糖，而不能催化水解來源于Saccharina cichorioides的巖藻聚糖。該酶更容易水解脫乙酰后的F.evanescens多糖巖藻聚糖，而對脫硫的巖藻聚糖水解作用非常弱。分析酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，這種海洋細(xì)菌合成的是一種α-L-巖藻糖苷酶，它可以通過內(nèi)切作用特異性地切斷由3-和4-交替連接、2位硫酸化的巖藻聚糖鏈中1-4糖苷鍵。Kim等[7]利用生物信息學(xué)的方法表達(dá)和純化了一種來自細(xì)菌Sphingomonas paucimobilis PF-1的巖藻聚糖降解酶（FNase S），它可以將高分子量（MF，1 246 kD）的巖藻糖降解為低分子量（小于4 kD）的半乳巖藻寡糖。進(jìn)一步研究表明FNase S是一種內(nèi)切型巖藻聚糖酶，它可以同時(shí)攻擊巖藻聚糖糖鏈，迅速制備出低分子量的半乳巖藻寡糖。

目前發(fā)現(xiàn)的可以降解巖藻聚糖硫酸酯的菌株大多來源于海洋[6-9]。一方面，受海洋特殊生長環(huán)境的影響，這些菌種的產(chǎn)酶性狀極不穩(wěn)定;另一方面，大部分巖藻聚糖降解酶活性都比較低，只能用于實(shí)驗(yàn)室小劑量巖藻聚糖的降解，目前還沒有商品化的巖藻聚糖降解酶。尋找一種性狀穩(wěn)定、易于培養(yǎng)、產(chǎn)酶效率高、活性高的可以降解巖藻聚糖硫酸酯的菌株成為整個(gè)問題的關(guān)鍵，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

該研究擬從江水和江泥中篩選可以降解巖藻聚糖硫酸酯的菌株，通過菌株的形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA種屬鑒定和進(jìn)化樹構(gòu)建，明確菌株的種屬，并且對粗酶液的熱穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度、最適pH和金屬離子對酶穩(wěn)定性影響進(jìn)行初步研究，以期為以后巖藻聚糖硫酸酯低聚糖的酶法制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 菌株來源于從南通市工農(nóng)南路濱江公園采集的江水樣本3份以及江泥樣品6份。

1.2 試劑

巖藻聚糖硫酸酯（中國科學(xué)院海洋研究所提供，分子量87.0 kD，巖藻糖24.8%，硫酸基26.5%，糖醛酸6.5%）、磷酸高鐵、硝酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸氫二鈉、氯化鈉、蛋白胨、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硫酸銨、瓊脂、吐溫-80、硫胺素、牛肉膏、巖藻糖、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、3，5-二硝基水楊酸、苯酚、草酸銨結(jié)晶紫、盧戈氏碘液、95%乙醇、番紅、硫酸銅、過氧化氫溶液（10%）、葡萄糖、肌酸、甲基紅試劑、磷酸二氫鈉、鹽酸溶液、甘氨酸、醋酸鈉、 冰醋酸、磷酸二氫鉀、硫酸鎳、硫酸錳、硫酸鋅、丙酮、瓊脂糖等試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純試劑。

1.3 培養(yǎng)基 A.富集培養(yǎng)基：巖藻聚糖硫酸酯3 g，硫酸鎂2 g，硝酸銨1.5 g，磷酸高鐵0.1 g，磷酸氫二鈉0.5 g，氯化鈣50 mg，蒸餾水1 000? mL，pH 7.0，1×105 Pa滅菌20 min。

B.分離培養(yǎng)基：巖藻聚糖硫酸酯7 g，氯化鈉25 g，硫酸銨2 g，磷酸氫二鉀1 g，蒸餾水1 000? mL，瓊脂20 g，pH 7.0，1×105 Pa滅菌20 min。

C.發(fā)酵培養(yǎng)基：巖藻聚糖硫酸酯9 g，氯化鈉25 g，硫酸銨3 g，硫酸高鐵1 g，磷酸氫二鉀1 g，吐溫-80 1? mL，硫胺6 μmol，蒸餾水1 000? mL，pH 7.5，1×105 Pa滅菌20 min。

D.復(fù)篩培養(yǎng)基：巖藻聚糖硫酸酯5 g，氯化鈉20 g，蛋白胨4 g，磷酸氫二鉀2 g，蒸餾水1 000? mL，pH 7.5，1×105 Pa滅菌20 min。

E.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000? mL，pH 7.4～7.6，1×105 Pa滅菌20 min。

F.斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000? mL，pH 7.4～7.6，1×105 Pa滅菌20 min。

G.液體培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，氯化鈉0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000? mL，1×105 Pa滅菌20 min。

1.4 菌種分離與純化 取10 g江泥或10? mL江水放入250 mL的三角瓶中，加入90? mL超純水稀釋振蕩混勻。然后取10? mL液體到100? mL富集培養(yǎng)基的三角瓶里，30 ℃、150 r/min，搖床富集培養(yǎng)72 h。然后吸取10? mL培養(yǎng)液到新鮮的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，重復(fù)同樣的步驟2～3次，接著在分離培養(yǎng)基劃線分離單菌落，挑選出有明顯液化圈的單菌落進(jìn)行反復(fù)劃線純化，最后在斜面培養(yǎng)基中保種。

1.5 酶活測定

1.5.1 發(fā)酵產(chǎn)酶。

將淡水來源菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min，搖床培養(yǎng)72 h。將新鮮海帶菌株接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min，搖床培養(yǎng)72 h。

1.5.2 粗酶液制備。

將菌液倒入雙層紗布中進(jìn)行過濾，濾液5 000 r/min，離心15 min，去除沉淀，再向上清液中加入-20 ℃的丙酮溶液，使丙酮濃度達(dá)50%，然后靜置一段時(shí)間后，溶液于5 000 r/min離心15 min，收集沉淀。再用0.07 mol/L的pH 6.5的KH2PO4-NaH2PO4緩沖液復(fù)溶，得到的溶液即為粗酶液。

1.5.3 DNS試劑配制。

將185 g酒石酸鉀鈉溶于500? mL蒸餾水，加熱溶解（溫度不宜超過50 ℃），再加入262? mL的2 mol/L的NaOH溶液，然后迅速加入6.3 g的3，5-二硝基水楊酸和5 g苯酚，加水定容至1 000? mL。

1.5.4 酶活測定。吸取0.05? mL粗酶液加入0.05? mL 1.0%巖藻聚糖溶液（pH 6.0的C6H8O7-NaHPO4的緩沖液）中，50? ℃水振蕩反應(yīng)10 min，加入0.3? mL DNS溶液，置于沸水浴中10 min，冷卻后，用蒸餾水定容至2.5? mL，充分混勻后，于550 nm處測定吸光值，同時(shí)以滅活的酶液作對照。

酶活力單位：在上述條件下，每分鐘釋放1 μmol相當(dāng)于巖藻聚糖的還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位，公式如下：

E=1.978×D×Y

式中，E表示巖藻聚糖降解酶的活力;1.978為換算系數(shù);D表示酶液的稀釋度;Y為550 nm下的吸光值。

1.6 菌種鑒定

1.6.1 生理生化鑒定。

對篩選所確定的菌株進(jìn)行培養(yǎng)特征、革蘭氏染色、莢膜染色、需氧性鑒定試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、二乙酰試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)等細(xì)菌生理生化試驗(yàn)，按“革蘭氏陰性桿菌新編碼鑒定”系統(tǒng)、API 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》對菌株進(jìn)行檢索[10]。

1.6.2 分子鑒定。提取基因組DNA，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F和1492R進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后送上海生工測序公司進(jìn)行測序，根據(jù)所得序列利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.7 酶活性試驗(yàn)

1.7.1 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。取粗酶液0.2? mL，在pH為7.0的條件下，于20、30、40、50、60、70和80 ℃條件下，各反應(yīng)30 min，快速用冷水冰至室溫，然后往試管中加入1 mL的0.05 mol/L巖藻聚糖硫酸酯緩沖液（pH=7.0），在45 ℃的條件下，反應(yīng)15 min后，迅速加入1? mL的DNS試劑，沸水水浴3 min，然后快速冷卻至室溫，最后加入蒸餾水定容至10 mL，于540 nm的光波下測量吸光度。

1.7.2 最適溫度試驗(yàn)。

取粗酶液0.2? mL，往試管中加入1? mL的0.05 mol/L巖藻聚糖硫酸酯緩沖液（pH=7.0），在pH為7.0的條件下，于25、30、35、40、45和50 ℃的溫度下，各反應(yīng)15 min后，迅速加入1? mL的DNS試劑，沸水水浴3 min，快速冷卻至室溫，然后加蒸餾水定容至10? mL，于540 nm的光波下測量吸光度。

1.7.3 金屬離子對酶活的影響。

取粗酶液0.2? mL，往試管中加入1? mL的1×10-2 mol/L金屬離子溶液和1? mL的0.05 mol/L巖藻聚糖硫酸酯緩沖液（pH=7.0），在pH為7.0的條件下，45 ℃反應(yīng)15 min后，再迅速加入1? mL的DNS試劑，沸水水浴3 min，快速冷卻至室溫，然后加蒸餾水定容至10? mL，于540 nm的光波下測量吸光度。

1.7.4 pH對酶活的影響。

取粗酶液0.2? mL，分別往試管中加入1? mL的pH不同的緩沖液（pH為2.0～3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH為4.0～6.0的醋酸緩沖液，pH為7.0～8.0的磷酸鹽緩沖液和pH為9.0～10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液），反應(yīng)60 min后，加入1? mL的0.05 mol/L巖藻聚糖硫酸酯緩沖液（pH=7.0），45 ℃反應(yīng)15 min，再迅速加入1? mL的DNS試劑，沸水水浴3 min，快速冷卻至室溫，然后加蒸餾水定容至10? mL，于540 nm的光波下測量吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及酶活測定

利用富集培養(yǎng)和唯一碳源的方法從江水和江泥樣本中分離純化得到9株可以利用巖藻聚糖硫酸酯的菌株，對其產(chǎn)酶情況進(jìn)行分析研究，其酶活測定結(jié)果見表1。從江水中分離得到的3株菌株和江泥中得到的6株菌株對巖藻聚糖硫酸酯都有一定的降解能力，其中酶活較高的JS3和JN3菌株的酶活達(dá)384、410 U。

2.2 菌株的基本生長特征與生理生化試驗(yàn) 選取產(chǎn)酶活性較高的2株菌株JS3和JN3進(jìn)行菌株鑒定和生理生化試驗(yàn)，結(jié)果如表2、3所示。這2株菌形態(tài)特征為革蘭氏陰性短桿菌，具有運(yùn)動性，在細(xì)菌培養(yǎng)基平板上生長形成規(guī)則的圓形菌落，呈奶白色，表面光滑濕潤，邊緣整齊。

2.3 菌株的系統(tǒng)分類地位

通過菌種外部形態(tài)觀察、各種生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA序列分析鑒定為克雷白氏桿菌（Klebsiella sp.），系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖1所示。

2.4 粗酶液性質(zhì)研究

2.4.1 酶的熱穩(wěn)定性。

粗酶液在pH 7.0的條件下，于20、30、40、50、60、70和80 ℃條件下處理30 min，立即用冰水冷至室溫，測定酶保持的活力。以20 ℃下處理后酶液的酶活力為100%。結(jié)果如圖2，JS3菌株粗酶液酶活在溫度升高至40 ℃時(shí)下降到80%，但是隨著溫度繼續(xù)升高酶活保持穩(wěn)定，在80 ℃時(shí)酶活依然高達(dá)80%。JN3菌株粗酶液酶活隨溫度的上升緩慢下降，當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，酶活迅速下降。2種粗酶液在40～70 ℃都表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。

2.4.2 酶的最適溫度。酶與底物在pH為7.0，不同溫度（25、30、35、40、45、50 ℃）下反應(yīng)，測定酶活。結(jié)果如圖3，JS3菌株產(chǎn)的粗酶液在35～45 ℃內(nèi)，酶活趨于穩(wěn)定且較高，45 ℃時(shí)達(dá)到最大酶活，超過45 ℃時(shí)，酶活開始下降，最佳反應(yīng)溫度為45 ℃。JN3菌株產(chǎn)的粗酶液在35～45 ℃內(nèi)，酶活趨于穩(wěn)定且較高，40 ℃時(shí)達(dá)到最大酶活，超過45 ℃時(shí)，酶活開始下降，最佳反應(yīng)溫度為40 ℃。

2.4.3 酶的pH穩(wěn)定性。粗酶液于pH不同的緩沖液中反應(yīng)，結(jié)果如圖4，在pH 4.0～7.0內(nèi)時(shí)，酶相對穩(wěn)定，JS3菌株粗酶液酶活保持在90%以上，JN3菌株粗酶液酶活保持在85%以上。超出此范圍，酶活迅速下降。

2.4.4 金屬離子對酶活的影響。在酶反應(yīng)體系中加入不同金屬離子，測定其活力。由圖5可知，當(dāng)離子濃度為1×10-2 mol/L時(shí)，Zn2+對JS3菌株粗酶液酶活有明顯的促進(jìn)作用，活力提高了20%，Mg2+和Ca2+對酶活也有一定促進(jìn)作用，但是Cu2+對酶活有顯著的抑制作用，酶活下降了50%。Mg2+對JN3菌株粗酶液酶活有明顯的促進(jìn)作用，活力提高了25%，Zn2+和Ca2+對酶活也有一定促進(jìn)作用，但是Cu2+對酶活有顯著的抑制作用，酶活下降了60%。Ni2+對2株菌的粗酶液都有一定抑制作用。

3 討論

巖藻聚糖硫酸酯降解酶主要來源于海洋微生物[11]、海洋軟體動物[12]以及棘皮動物[13]，其中微生物是巖藻聚糖硫酸酯降解酶的主要來源。微生物來源主要包括弧菌[14]、交替假單胞菌（Pseudoalteromonas sp.） [15]、交替單胞菌（Alteromonas sp.） [16]等海洋細(xì)菌以及真菌[17]。該研究選取南通濱江公園江水、江泥為樣本，分別篩選出高活性的菌株JS3、JN3。通過細(xì)菌外部形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA序列分析鑒定JN3、JS3為克雷白氏桿菌屬（Klebsiella sp.）。目前，從該屬中發(fā)現(xiàn)巖藻聚糖硫酸酯降解酶鮮見報(bào)道。

菌株粗酶液降解巖藻聚糖硫酸酯的活性是評價(jià)菌株是否能有效降解巖藻聚糖硫酸酯的最重要標(biāo)準(zhǔn)。陳惠源等[18]從食鞘氨醇桿菌中制備的巖藻聚糖硫酸酯降解酶粗酶液的活性為130 U，Wu等[19]獲得了一株具有巖藻聚糖硫酸酯降解活性的菌株Dendryphiella arenaria TM94，其粗酶液的酶活為379 U。該研究報(bào)道的2株菌JS3和JN3的粗酶活達(dá)384、410 U，其活性高于食鞘氨醇桿菌的降解活性，和TM94的活性差不多。JS3和JN3分別來自江水和江泥，是淡水菌株，和海水來源的菌株相比，培養(yǎng)條件更加簡單，產(chǎn)酶活性高，且酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是2株有潛力的新型具有巖藻聚糖硫酸酯降解活性的菌株。

JN3和JS3菌株粗酶液的酶活活性的研究表明這2種菌產(chǎn)生的巖藻聚糖硫酸酯降解酶的熱穩(wěn)定比較強(qiáng)，溫度上升后，也能保持很高的酶活性，其中JN3的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，JS3的最適反應(yīng)溫度為45 ℃。在20～50 ℃的反應(yīng)區(qū)間內(nèi)，2株菌的粗酶均能保持較高的活性，這說明該酶降解巖藻聚糖硫酸酯時(shí)對反應(yīng)溫度要求不高，方便在不同的環(huán)境中使用。JN3、JS3的巖藻聚糖硫酸酯降解酶的活力與pH有關(guān)，在pH為4.0～7.0時(shí)均能保持較好的活性，在pH 5.0時(shí)呈現(xiàn)出最大活性。Sakai等[20]分離得到一株降解巖藻聚糖的菌株，屬于產(chǎn)黃菌素屬（Flavobacteriacea sp.），其酶活最適反應(yīng)溫度為30～35 ℃，pH為6.5～8.0。而該試驗(yàn)篩選出JN3、JS3菌株中降解酶反應(yīng)溫度和對酸堿環(huán)境適應(yīng)范圍都比Sakai等分離的菌株更加寬廣，在溫度為30～50 ℃和pH在4.0～7.0時(shí)都能保持很高的活性。

金屬離子對于酶活有一定影響，Mg2+、Ca2+、Zn2+對JN3、JS3中酶均有一些激活作用，而Cu2+強(qiáng)烈抑制酶活，Ni2+也在一定程度上抑制酶活性。與馮蕾等[21]的研究結(jié)果相同，推測Ca2+、Mg2+、Zn2+等離子可以和酶活性中心作用，使酶活中心結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使酶的活性增加。而Cu2+和Ni2+占據(jù)了酶活中心的活性位點(diǎn)，使酶不能與多糖作用而產(chǎn)生相應(yīng)的降解活性。

4 結(jié)論

該研究從江水、江泥中篩選獲得了2株高活性的具有巖藻聚糖硫酸酯降解活性的菌株JS3和JN3，其粗酶活性高達(dá)384、410 U。經(jīng)鑒定，2株菌均屬于克雷白氏桿菌（Klebsiella sp.），這是首次從該菌屬中發(fā)現(xiàn)具有巖藻聚糖硫酸酯降解活性的菌株。通過對粗酶活性研究，發(fā)現(xiàn)該酶具有較好的熱穩(wěn)定性和較寬的pH使用范圍，但是該酶的降解性質(zhì)及底物特異性如何是值得深入研究的課題。該研究為進(jìn)一步開發(fā)巖藻聚糖硫酸酯降解酶及利用其來制備巖藻聚糖硫酸酯低聚糖和寡糖等提供了先決條件。

參考文獻(xiàn)

[1]DENIAUD-BOUT E，HARDOUIN K，POTIN P，et al.A review about brown algal cell walls and fucose-containing sulfated polysaccharides：Cell wall context，biomedical properties and key research challenges[J].Carbohydrate polymers，2017，175：395-408.

[2] WANG J，ZHANG Q B，JIN W H，et al.Effects and mechanism of low molecular weight fucoidan in mitigating the peroxidative and renal damage induced by adenine[J].Carbohydrate polymers，2011，84（1）：417-423.

[3] 陳蕾，吳皓.多糖降解方法的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（1）：133-135.

[4] VICKERS C，LIU F，ABE K，et al.Endo-fucoidan hydrolases from glycoside hydrolase family 107 （GH107） display structural and mechanistic similarities to α-L-fucosidases from GH29[J].Journal of biological chemistry，2018，293（47）：18296-18308.

[5] BERTEAU O，MULLOY B.Sulfated fucans，fresh perspectives：Structures，functions，and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide[J].Glycobiology，2003，13（6）：29R-40R.

[6] SILCHENKO A S，KUSAYKIN M I，KURILENKO V V，et al.Hydrolysis of fucoidan by fucoidanase isolated from the marine bacterium，F(xiàn)ormosa algae[J].Marine drugs，2013，11（7）：2413-2430.

[7] KIM W J，PARK J W，PARK J K，et al.Purification and characterization of a fucoidanase （FNase S） from a marine bacterium Sphingomonas paucimobilis PF-1[J].Marine drugs，2015，13（7）：4398-4417.

[8] SILCHENKO A S，IMBS T I，ZVYAGINTSEVA T N，et al.Brown alga metabolites-inhibitors of marine organism fucoidan hydrolases[J].Chemistry of natural compounds，2017，53（2）：345-350.

[9] OHSHIRO T，OHMOTO Y，ONO Y，et al.Isolation and characterization of a novel fucoidan-degrading microorganism[J].Bioscience，biotechnology，and biochemistry，2010，74（8）：1729-1732.

[10] HOLT J G，KRIEG N R，SNEATH P H A，et al.Bergeys manual of determinative bacteriology[M].9th ed.Baltimor：William & Wilkins，1994：87.

[11] SASAKI K，SAKAI T，KOJIMA K，et al.Partial purification and characterization of an enzyme releasing 2-sulfo-α-L-fucopyranose from 2-sulfo-α-L-fucopyranosyl-（1→2）pyridylaminated fucose from a sea urchin，Strongylocentrotus nudus[J].Bioscience，biotechnology，and biochemistry，1996，60（4）：666-668.

[12] DESCAMPS V，COLIN S，LAHAYE M，et al.Isolation and culture of a marine bacterium degrading the sulfated fucans from marine brown algae[J].Marine biotechnology，2006，8（1）：27-39.

[13] SILCHENKO A S，KUSAYKIN M I，ZAKHARENKO A M，et al.Endo-1，4-fucoidanase from Vietnamese marine mollusk Lambis sp.which producing sulphated fucooligosaccharides[J].Journal of molecular catalysis B：Enzymatic，2014，102：154-160.

[14] FURUKAWA S I，F(xiàn)UJIKAWA T，KOGA D，et al.Production of fucoidan-degrading enzymes，fucoidanase，and fucoidan sulfatase by Vibrio sp.N-5[J].Nippon suisan gakkaishi，1992，58（8）：1499-1503.

[15] IVANOVA E P，BAKUNINA I Y，SAWABE T，et al.Two species of culturable bacteria associated with degradation of brown algae Fucus evanescens[J].Microbial ecology，2002，43（2）：242-249.

[16] SAKAI T，KAWAI T，KATO I.Isolation and characterization of a fucoidan-degrading marine bacterial strain and its fucoidanase[J].Marine biotechnology，2004，6（4）：335-346.

[17] RODRGUEZ-JASSO R M，MUSSATTO S I，PASTRANA L，et al.Fucoidan-degrading fungal strains：Screening，morphometric evaluation，and influence of medium composition[J].Applied biochemistry and biotechnology，2010，162（8）：2177-2188.

[18] 陳惠源，蔡俊鵬，劉江濤.巖藻多糖降解酶產(chǎn)生菌的篩選及鑒定[J].現(xiàn)代食品科技，2005，21（3）：42-44.

[19] WU Q Q，ZHANG M，WU K，et al.Purification and characteristics of fucoidanase obtained from Dendryphiella arenaria TM94[J].Journal of applied phycology，2011，23（2）：197-203.

[20] SAKAI T，KIMURA H，KATO I.A marine strain of Flavobacteriaceae utilizes brown seaweed fucoidan[J].Marine biotechnology，2002，4（4）：399-405.

[21] 馮蕾，唐學(xué)璽，王艷玲，等.褐藻酸降解酶特性的初步研究[J].海洋科學(xué)，2006，30（2）：30-33.

基金項(xiàng)目 海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室開放課題（0F2015N007）。

作者簡介 劉淮德（1981—），男，山東濰坊人，講師，博士，從事海洋生物學(xué)相關(guān)研究。*通信作者，副研究員，博士，從事海洋藥物學(xué)相關(guān)研究。

收稿日期 2020-08-13