華蟾素在泌尿系腫瘤中的治療研究進(jìn)展

吳瀟蕓 易楚繁 付偉金

[專(zhuān)家介紹]付偉金， 醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，畢業(yè)于復(fù)旦大學(xué)，德國(guó)魯爾大學(xué)和美國(guó)德克薩斯大學(xué)訪問(wèn)學(xué)者?，F(xiàn)任中國(guó)醫(yī)療保健國(guó)際交流促進(jìn)會(huì)泌尿健康促進(jìn)分會(huì)術(shù)后快速康復(fù)學(xué)部委員，廣西醫(yī)師協(xié)會(huì)泌尿外科分會(huì)常委，廣西醫(yī)學(xué)會(huì)泌尿外科分會(huì)委員等。主要從事泌尿系統(tǒng)腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。目前主持國(guó)家及省部級(jí)課題4項(xiàng)，已培養(yǎng)研究生7名，在讀碩士研究生8名。自2005年以來(lái)，以第一作者或通信作者身份在國(guó)內(nèi)外核心期刊發(fā)表論文60篇，其中SCI收錄8篇。

【摘要】 華蟾素是傳統(tǒng)中藥，具有解毒、抗炎作用，對(duì)肝癌、肺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤具有抗癌作用，其機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、破壞細(xì)胞周期、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等有關(guān)。近年華蟾素在治療泌尿系腫瘤基礎(chǔ)研究方面取得初步成功，現(xiàn)就其在泌尿系腫瘤中的治療及相關(guān)機(jī)制進(jìn)展作一綜述。

【關(guān)鍵詞】 華蟾素;泌尿系腫瘤;作用機(jī)理

中圖分類(lèi)號(hào)：R737 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.11.002

【Abstract】 ? Bufalin is a traditional Chinese medicine with detoxification and anti-inflammatory functions. It has anticancer effect on many kinds of malignant tumors， such as liver cancer， lung cancer and pancreatic cancer， etc. Its mechanism may be related to inhibiting tumor cell proliferation， promoting cell apoptosis， destroying cell cycle and reversing multidrug resistance， etc. In recent years， bufalin has achieved initial success in the treatment of urinary tract tumors on basic research fields. This article reviews the progress of bufalin in the treatment of urinary tract tumors and related mechanisms.

【Key words】 bufalin; genitourinary tumors; mechanism of action

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)中醫(yī)藥材逐漸成為當(dāng)今治療腫瘤的重要手段及治療策略，主要在于其不僅對(duì)腫瘤具有顯著抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，而且對(duì)機(jī)體的損傷及副作用小。因此，研究中藥材抗腫瘤效應(yīng)具有廣闊的臨床應(yīng)用價(jià)值。華蟾素是由中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺的分泌物提煉出來(lái)的一種生物活性多羥基類(lèi)固醇，主要成分是蟾毒靈及吲哚生物堿等，屬于地高辛類(lèi)物質(zhì)，是一種傳統(tǒng)中藥。華蟾素具有消炎、止痛、抗腫瘤等多種功效。近年研究表明，華蟾素對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用并可誘導(dǎo)其凋亡[1～3]，其作用機(jī)制可能為抑制腫瘤相關(guān)信號(hào)通路如磷酸肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)（mTOR）、Wnt/β-catenin等[4～6]，從而影響腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)變（EMT）、腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)凋亡、破壞細(xì)胞周期、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性等多種惡性生物學(xué)行為[1～3]。近年，華蟾素在泌尿系腫瘤基礎(chǔ)研究方面取得初步成功，本文現(xiàn)就華蟾素在泌尿系腫瘤中的治療研究進(jìn)展作一綜述。

1 華蟾素治療前列腺癌

前列腺癌是歐美國(guó)家男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤[7]，位居男性因癌死亡的第二位。前列腺癌患者接受雄激素剝除治療（androgern deprivation therapy，ADT）可抑制前列腺癌進(jìn)展，前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）下降，改善晚期或轉(zhuǎn)移性患者總生存率（overall survival，OS）。但經(jīng)過(guò)平均18個(gè)月的抗雄激素治療，雖然血清睪酮的濃度維持在去勢(shì)水平以下，但患者會(huì)從雄激素依賴(lài)性（androgen dependence，AD）轉(zhuǎn)變?yōu)槿?shì)抵抗性前列腺癌（castration resistance prostate cancer，CRPC），表現(xiàn)為PSA上升，疾病進(jìn)展如內(nèi)臟及骨轉(zhuǎn)移灶增多等，CRPC患者臨床預(yù)后差，是目前治療的難點(diǎn)。因此發(fā)現(xiàn)新型治療藥物對(duì)于提高CRPC患者預(yù)后十分重要[8]。

2003年有學(xué)者首次證實(shí)華蟾素可抑制雄激素依賴(lài)前列腺癌細(xì)胞LNCaP及雄激素非依賴(lài)DU145和PC3細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、caspase-9表達(dá)升高，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，認(rèn)為華蟾素促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制可能與華蟾素破壞細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)酶表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，該研究的初步結(jié)果為華蟾素在泌尿系腫瘤中的應(yīng)用揭開(kāi)了序幕。2008年，YU等[9]研究也證實(shí)了華蟾素可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能與其上調(diào)Bax、細(xì)胞色素c、caspase等凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)華蟾素可延緩前列腺癌細(xì)胞LNCaP、DU-145和PC3細(xì)胞增殖時(shí)間，促進(jìn)Bax、細(xì)胞色素c，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白等表達(dá)增強(qiáng)。在表達(dá)野生型P53基因的LNCaP細(xì)胞中，抑癌基因P53表達(dá)增強(qiáng)，反義TP53轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞活力明顯下降;而突變型P53的DU145和PC3細(xì)胞內(nèi)Fas表達(dá)明顯高于LNCaP細(xì)胞。小干擾RNA- Fas（small interfering RNA，siRNA）下調(diào)Fas表達(dá)后可提高腫瘤細(xì)胞活力。研究結(jié)果證實(shí)表達(dá)野生型P53的LNCaP細(xì)胞的上游誘導(dǎo)因子為P53和Fas，表達(dá)突變型P53的DU145和PC3上游誘導(dǎo)因子為Fas。

微小RNA（Micro RNAs，miRNAs）是一種內(nèi)源性非編碼長(zhǎng)度為19～25核苷酸的小分子RNA，通過(guò)結(jié)合靶蛋白的3'-非翻譯區(qū)（untranslational region，UTR），從而抑制靶蛋白翻譯并誘導(dǎo)mRNA切割形成。研究證實(shí)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，miRNAs充當(dāng)調(diào)節(jié)分子，起癌基因或抑癌作用[10～11]。miRNAs表達(dá)失調(diào)時(shí)可刺激細(xì)胞增殖和侵襲，增加腫瘤血管生成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。2013年，ZHAI等[12]證實(shí)華蟾素抗腫瘤機(jī)制可能與調(diào)控miRNAs表達(dá)有關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)華蟾素作用于前列腺癌PC3細(xì)胞后，可下調(diào)PC3細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）發(fā)現(xiàn)華蟾素可誘導(dǎo)MiR-181a的表達(dá)增加，呈劑量依賴(lài)關(guān)系。而MiR-181a抑制劑可降低caspase-3表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，降低PC3細(xì)胞凋亡。提示MiR-181a是一種抑癌分子，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)因子。當(dāng)華蟾素作用于前列腺癌細(xì)胞時(shí)，可使細(xì)胞內(nèi)MiR-181a表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長(zhǎng)度大于200 bp，不編碼蛋白質(zhì)的RNA，已證實(shí)lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，它可通過(guò)海綿吸附相關(guān)的下游miRNA，影響其表達(dá)，稱(chēng)為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），從而影響miRNA調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。從ZHAI等[12]的研究結(jié)果得到啟發(fā)，ZHANG等[13]使用lncRNA基因芯片檢測(cè)經(jīng)華蟾素預(yù)處理的前列腺癌細(xì)胞PC3細(xì)胞，與對(duì)照組相比，lncRNA HOTAIR在華蟾素預(yù)處理組的前列腺癌細(xì)胞中，表達(dá)顯著下調(diào)。過(guò)表達(dá)lncRNA HOTAIR可逆轉(zhuǎn)華蟾素對(duì)前列腺癌DU145和PC3細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)一步研究證實(shí)lncRNA HOTAIR與miR-520b存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用，而miR-520b可抑制成纖維生長(zhǎng)因子受體1表達(dá)（FGFR1）。他們認(rèn)為華蟾素作用于前列腺癌細(xì)胞后，可下調(diào)lncRNA HOTAIR表達(dá)，從而導(dǎo)致miR-520b表達(dá)上調(diào)，抑制FGFR1表達(dá)后，導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲力下降。ZHANG等[14]發(fā)現(xiàn)華蟾素可誘導(dǎo)前列腺癌LNCaP細(xì)胞發(fā)生caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)，降低雄激素受體及PSA、類(lèi)固醇受體共激活因子（steroid receptor coactivator，SRC）1、3蛋白表達(dá)水平;阻滯腫瘤細(xì)胞于G2期;誘導(dǎo)CYR61、CTGF衰老相關(guān)基因表達(dá);增加P53及其下游細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P21cip蛋白豐度，TP53-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后下調(diào)衰老相關(guān)半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase activity，SA-βgal）表達(dá);還可降低細(xì)胞裸鼠腫瘤模型生長(zhǎng)，治療9周腫瘤重量較對(duì)照組降低67%（P<0.05），SA-βgal活性增強(qiáng)。研究結(jié)果提示華蟾素可能通過(guò)P53/P21cip信號(hào)軸誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老，抑制細(xì)胞增殖。

以上研究證實(shí)華蟾素抑制前列腺癌惡性生物學(xué)行為的機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制增殖、影響lncRNA和miRNAs表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞衰老等有關(guān)，提示其有可能成為治療晚期前列腺癌的新型藥物。

2 華蟾素治療膀胱癌

膀胱癌是泌尿系常見(jiàn)腫瘤，非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)治療是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)+術(shù)后膀胱灌注，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)治療是根治性膀胱腫瘤切除術(shù)。晚期或轉(zhuǎn)移性膀胱癌臨床預(yù)后差，無(wú)有效治療方法。因此發(fā)現(xiàn)新型和有效治療藥物對(duì)于提高膀胱癌患者預(yù)后十分重要。

HONG等[15]探討華蟾素對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)華蟾素可阻滯細(xì)胞于G2/M期;誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9前體蛋白表達(dá)濃度顯著增加;JC-1染色提示腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降;抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL及凋亡抑制因子X(jué)IAP、cIAP-1和cIAP-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào);誘導(dǎo)細(xì)胞表面跨膜受體Fas、死亡受體4（death receptor，DR4）、DR5和促凋亡配體TRAIL的mRNA及蛋白水平呈濃度依賴(lài)性增加。研究結(jié)果提示華蟾素抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與激活線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑和死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑有關(guān)。HUANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)華蟾素作用于膀胱癌T24細(xì)胞后，可抑制細(xì)胞活力。DAPI/TUNEL雙重染色檢測(cè)提示細(xì)胞DNA凝集及凋亡增多，阻滯細(xì)胞于G0/G1期;上調(diào)抑癌基因Rb表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期素D（cyclin D）、細(xì)胞周期素E（cyclin E）、細(xì)胞周期依賴(lài)激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）2、CDK4及磷酸化Rb（p-Rb）的表達(dá)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多導(dǎo)致產(chǎn)生細(xì)胞毒作用;降低線粒體膜電位水平，增加細(xì)胞中細(xì)胞色素c、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）、凋亡蛋白酶活化因子1（apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）水平，促進(jìn)caspase-3、caspase-7和caspase-9活化，激活線粒體依賴(lài)的凋亡通路誘導(dǎo)凋亡。Bufalin還可降低Akt活性及磷酸化Akt（p-Akt）和抗凋亡蛋白Bcl-2水平，增加Bax水平，提示通過(guò)改變Bax/Bcl-2比例和降低Akt活性可調(diào)控膀胱癌細(xì)胞凋亡。HUANG等[17]對(duì)華蟾素誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡及其機(jī)制進(jìn)行探討。研究結(jié)果提示華蟾素通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)caspase-3表達(dá)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可抑制Na+-K+-ATP酶α3亞基表達(dá)。而轉(zhuǎn)染α3亞基過(guò)表達(dá)質(zhì)粒使Na+-K+-ATP酶α3亞基過(guò)表達(dá)，明顯減弱華蟾素抗腫瘤功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡減少作用。提示華蟾素促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與下調(diào)Na+-K+-ATP酶的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2020-08-06 修回日期：2020-09-25）

（編輯：潘明志）