富血小板血漿在組織工程研究中的應用現(xiàn)狀

段江濤，朱倫井，彭稱飛，王寧，陳俊毅，貝朝涌

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院四肢創(chuàng)傷骨科，廣西 桂林）

0 引言

富血小板血漿（PRP）是血液濃縮產(chǎn)物，含有大量血小板，可通過離心或血液分離技術得到。

全血離心后，可以明顯區(qū)分紅細胞層和血漿層。在中間可以找到含有大部分白細胞和血小板的血沉棕黃層，再將其用于制備PRP。在某些方案中，對血沉棕黃層/血漿層再次離心可獲得更純化濃縮的PRP[1]。

傳統(tǒng)上將PRP定義為含濃度至少200-1，000×103/μL血小板的血漿[2]。根據(jù)PRP的激活方法分為內(nèi)源性和外源性激活[3]。多使用凝血酶和/或氯化鈣激活PRP[4]，激活后形成水凝膠，其可持續(xù)分泌生長因子[5]，并可運載細胞[5-6]。

血小板可釋放轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β），成纖維細胞生長因子2，血小板衍生生長因子的亞型（PDGF-AA，PDGF-AB，PDGFBB），胰島素樣生長因子-1，表皮生長因子和肝細胞生長因子[7]。Jalowiec等[5]的研究表明，凝血酶活化形成的血小板凝膠中血小板濃度與蛋白質(zhì)的分泌之間呈正相關，并且在凝膠化后最初的4小時內(nèi)觀察到生長因子釋放峰值。在不同血小板濃度下均發(fā)現(xiàn)TGF-β1的高水平釋放，其次是PDGF-AB和PDGF-BB。此外，他們發(fā)現(xiàn)PRP凝膠還釋放了炎癥介質(zhì)，釋放最多的是趨化因子CCL5。與此對應，El-Sharkawy等[8]報道了PRP中生長因子的高水平。此外，他們還發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)介體脂蛋白A4含量增加，已知其與炎癥消除有關。因此，PRP可釋放細胞因子并可抑制炎癥反應。

PRP存在生物學差異，不同的制備方法會加劇這種差異[9]。kushida等[10]報道了七種商業(yè)制備系統(tǒng)制備的活化PRP中生長因子濃度的巨大差異。Mazzocca等[11]從8位健康受試者身上抽取血液，除了一步離心法和兩步離心法在血小板濃度方面的差異外，他們還強調(diào)了不管如何選取分離方法，血小板計數(shù)和生長因子濃度存在著顯著個體差異。

盡管PRP暫時達不到統(tǒng)一的標準化制備，其已被廣泛地應用于臨床。PRP的應用旨在基于其含有的豐富生長因子，通過各種未盡知的機制來促進組織再生。Hsu等[12]回顧了骨水泥中加入PRP在肌肉骨骼再生中的應用，并指出了多種因素對治療成功與否的影響。

根據(jù)白細胞含量多寡可以分為貧白細胞和富白細胞PRP。應根據(jù)應用部位來選擇PRP中白細胞的濃度。例如，貧白細胞PRP適用于關節(jié)腔內(nèi)注射[13,14]。除骨科和運動醫(yī)學外，醫(yī)學其他領域也已有PRP的多種治療應用。

1 組織工程中的PRP

骨、軟骨、皮膚和軟組織修復，各種組織工程研究中均有PRP的應用。除將PRP當作生長因子來源外，更多的作為生長因子和/或細胞的遞送體與生物材料相結(jié)合來構建工程復合體。在這些研究中，PRP的制備以及使用方法多樣，特別是血小板的濃度、是否進行活化以及活化方法的選擇。比較各研究中PRP功效的主要障礙是：（1）所有血小板產(chǎn)品都存在較大的供體變異，（2）血小板的濃度、是否進行活化以及活化方法的選擇沒有統(tǒng)一標準。有研究系統(tǒng)地驗證了不同血小板濃度對生長因子釋放和摻入PRP凝膠中的細胞的影響，也突顯了這一障礙[5]。這項研究結(jié)果表明，釋放的生長因子的濃度與血小板濃度密切相關，并且對MSC的活力和增殖有影響，對比分析后發(fā)現(xiàn)最有利的血小板濃度為1，000×103/μL（3.3到6.7倍）[5]。

2 復合支架應用于骨缺損修復

PRP最多用于骨組織工程領域，已作為細胞載體和/或成骨和成血管的生長因子來源。2005年Hokugo等人[15]報道PRP與可降解的生物材料凍干水基明膠結(jié)合具有促進體內(nèi)骨修復的作用。在這項研究中，研究者將平均血小板濃度為1，200×103/μL（6倍）的兔PRP包被在凍干水基明膠上，結(jié)果表明，向明膠中添加PRP會導致血小板活化釋放生長因子，類似于凝血 酶活化。在兔尺骨缺損模型中測試了這種復合材料的成骨誘導特性，并與單獨使用明膠、單獨應用PRP或PRP結(jié)合纖維蛋白進行了比較，其中PRP復合明膠組新生骨形成最明顯。他們假設這種增強成骨的作用來源于凍干水基明膠可捕獲PRP釋放的生長因子，從而在水凝膠降解時持續(xù)釋放多種生長因子[15]。還有其他研究將PRP與各種陶瓷材料結(jié)合在一起。El Backly等[16]將PRP與羥基磷灰石-β-磷酸三鈣支架（SkeliteTM）結(jié)合使用，并在臨界大小的兔顱骨缺損中進行了測試。在支架上添加濃度為3，000×103/μL的凍干人PRP后，使用凝血酶和葡萄糖酸鈣激活。結(jié)果表明，激活PRP可提高顱骨缺損內(nèi)的細胞及類骨質(zhì)沉積，這歸因于PRP的化學吸引作用[16]。

骨組織工程還將PRP與細胞結(jié)合使用，其中PRP既可作為細胞載體，又可作為自體生長因子的供體來源。在Kretlow等人的研究中[17]將未培養(yǎng)的骨髓單個核細胞放于珊瑚羥基磷灰石支架或聚（L-乳酸）支架中，一組復合（8.6±3.2倍）PRP，一組不復合進行研究。在臨界大小的大鼠顱骨缺損模型中，骨髓單個核細胞對成骨具有促進作用，而復合PRP并不能增強成骨作用。與之相反，在納米硫酸鈣支架和BMP-2修飾的MSC中添加PRP（未指定血小板濃度）可促進成骨[18]。

除了促進成骨分化外，PRP還被用作MSC和內(nèi)皮祖細胞的載體，以促進骨組織工程復合體中血管的形成[19]。這項研究證明了PRP（濃度2，000×103/μL）可作為內(nèi)皮祖細胞的載體，皮下移植即可在植入物內(nèi)促進新血管形成[17]。原因可能是PRP釋放的生長因子中血管生長因子的含量高[5]。Zahn等人最近的一項研究證明了PRP作為促血管生成細胞遞送載體的功能。[6]PRP凝膠（血小板濃度2，000×103/μL）能夠包裹人臍靜脈內(nèi)皮細胞和MSC來形成血管樣結(jié)構。

3 骨軟骨及軟骨缺損修復

PRP在組織工程中的應用不僅限于骨組織。一些實驗已經(jīng)研究了PRP在骨軟骨和軟骨修復中的作用。大多數(shù)研究都將PRP作為軟骨細胞或祖細胞的載體。例如，Xie等人[20]發(fā)表了一項對比實驗，檢測了PRP輸送的骨髓MSC和ASC的骨軟骨修復再生潛力。雖然單獨應用PRP（平均濃度為1，670×103/μL）不具有再生能力，但兩種細胞復合PRP均能介導軟骨基質(zhì)的形成[20]。

4 牙科應用

在顱頜面部應用中特別進行了PRP的研究。一份臨床報告表明，在植入牙種植體后以PRP凝膠形式將MSC植入竇底以增強其功能，2至6年的隨訪期內(nèi)顯示出積極的結(jié)果[19]。

5 軟組織修復

最近的流變學研究中已確定，PRP活化后會形成柔軟的水 凝膠[5]。它因此成為軟組織修復的最佳材料。PRP已被用于脂肪和皮膚損傷修復，并用作粘合劑來閉合傷口。例如，有研究顯示，固定在明膠微球上的PRP（平均富集6.4倍）可促進皮下植入后脂肪的血管形成[21]。據(jù)報道，由PRP、貧血小板血漿制備的冷沉淀、凝血酶混合產(chǎn)生的膜樣物質(zhì)可作為生物活性粘合劑，在慢性潰瘍小鼠模型中介導傷口修復[22]。

6 總結(jié)

綜上，PRP已在各種組織工程研究中得到應用，并且結(jié)果不禁相同。在這些研究中對PRP的使用包括1.利用PRP作為自體水凝膠細胞載體2.用作促進細胞粘附、血管生成或組織再生的生長因子來源。對于后者，一些研究提示了在更長的時間內(nèi)維持生長因子釋放的重要性，例如，使用明膠或肝素結(jié)合的纖維蛋白水凝膠包裹活化PRP來緩釋生長因子。不足的是大多數(shù)研究并未探究PRP的作用方式。此外，PRP一般會作為材料的一部分用于與細胞和生物材料復合，此類設計無法明確單個成分的作用。這些不足說明了在組織工程研究中PRP的作用特點、作用大小仍然不明確。

作為生長因子的自體遞送載體，PRP具有將組織工程學方法發(fā)展成為再生療法的固有部分的潛力。為了在臨床環(huán)境中PRP應用的安全性和可預測性，將來進行系統(tǒng)且深入的研究至關重要。