研究膽堿能受體激動(dòng)劑對(duì)天皰瘡棘層松解的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制

艾潔

（內(nèi)蒙古包頭市腫瘤醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭）

0 引言

天皰瘡是一類原因尚未明確的自身免疫性大皰性疾病類型，臨床上一般選用足量糖皮質(zhì)激素予以治療，若病情過(guò)于嚴(yán)重者可行血漿交換療法，一般尋常性天皰瘡可經(jīng)久不愈。天皰瘡多發(fā)于老年群體，病程較為緩慢，病情進(jìn)展緩慢時(shí)，雖不致命，但病情嚴(yán)重且經(jīng)常復(fù)發(fā)的情況下，便可危及生命，因此需選用具有及時(shí)性和針對(duì)性的臨床治療手段實(shí)行相應(yīng)治療，緩解并控制病情，積極促進(jìn)病情轉(zhuǎn)優(yōu)。選用糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療可有效緩解天皰瘡患者的皮膚癥狀，降低天皰瘡導(dǎo)致的病死率，同時(shí)積極促進(jìn)病情轉(zhuǎn)優(yōu)，但選用糖皮質(zhì)激素予以治療會(huì)發(fā)生不確定性的不良反應(yīng)，若不良反應(yīng)太過(guò)嚴(yán)重，會(huì)直接危及天皰瘡患者的生命安全，不僅不能降低天皰瘡的病死率，反而會(huì)因不良反應(yīng)使病死率持續(xù)增長(zhǎng)[1-3]。有相關(guān)研究表明，乙酰膽堿液可在改善天皰瘡患者的臨床癥狀中發(fā)揮一定效用，膽堿能激動(dòng)劑對(duì)棘層松解有一定程度的抑制作用，但目前還未明確具體作用機(jī)制，因而本次研究決定對(duì)天皰瘡棘層松解的相關(guān)情況進(jìn)行針對(duì)性的探究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

抽取某院皮膚科2017 年2 月至2020 年2 月收治的46 例天皰瘡患者參與研究調(diào)查，年齡在20～75 歲，平均（50.23±6.19）歲。

1.2 方法及標(biāo)準(zhǔn)

參照《2014 EDF/EADV 天皰瘡診斷和治療指南（s2）-皮膚性指南》制定標(biāo)準(zhǔn)：正常HaCaT 細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科皮膚病研究所提供）和10% 胎牛血清-DMEM 培養(yǎng)液（美國(guó)Life Technnologies 公司提供）。將尋常型天皰瘡患者和正常體檢者血清純化后可得尋常型和正常型的IgG（免疫球蛋白G），濃縮后可得20 g/L 的IgG，橋粒芯蛋白抗體--653 U/mL，Dsg1 抗體--343 U/mL，免疫球蛋白G 的終濃度--1g/L[4-5]。

實(shí)驗(yàn)所用試劑--卡巴膽堿（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；分散酶Ⅱ；上樣緩沖液、鼠抗人Dsg3 抗體、MOPS 電泳緩沖液、Trizol、Bis-tris 預(yù)制膠（美國(guó)Life Technnologies 公司）；磷酸化p38 MAPK、磷酸化EGFR 抗體、表皮生長(zhǎng)因子受體（美國(guó)Cell Signal Technology 公司）、免疫印跡洗脫液、免疫共沉淀試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher scientific 公司）；鼠抗人橋斑珠蛋白抗體（美國(guó)BD 公司）；HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體、Triton X-100 裂解液、RIPA 裂解液、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 抗體；qPCR 試劑盒；橋粒芯蛋白抗體檢測(cè)試劑盒；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等各項(xiàng)所用試劑。

分組--將HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行合適分組（至80%時(shí)劃分）：正常組；PV-IgG 組；NH-IgG+ 卡板膽堿和PV-IgG+卡巴膽堿組[6-7]。

HaCaT 細(xì)胞解離實(shí)驗(yàn)-- 用磷酸鹽緩沖液沖洗HaCaT細(xì)胞，加入分散酶Ⅱ后放于37° 的孵箱中，30 min 后，將培養(yǎng)皿與細(xì)胞單層相分離，最后在機(jī)械力的作用下使細(xì)胞出現(xiàn)解離。

免疫熒光-- 細(xì)胞經(jīng)處理清洗后，加入4% 的多聚甲醛固定10 min；清洗后，加入0.1% Triton X-1005 min 后再清洗。加入抗體孵育1 h，二抗45 min；加入7.5 mg/L Hoeches 33342 染色，標(biāo)記細(xì)胞核。

蛋白抽提--HaCaT 細(xì)胞清洗后，加入Triton X-100 裂解液或RIPA，裂解細(xì)胞，當(dāng)HaCaT 細(xì)胞全面裂解后，將細(xì)胞裂解出的膜蛋白和胞質(zhì)蛋白抽提出來(lái)；將抽提后的溫度維持在4 ℃左右，待5 min 后，在培養(yǎng)皿的一端迅速將細(xì)胞裂解液快速刮于其上（選用細(xì)胞刮），吸至離心管中，離心15 min 后收集上清液。

免疫印跡-- 蛋白定量后，混合提取后的蛋白與上樣緩沖液，加熱變性后上樣。一系列正常操作后，三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液洗去未結(jié)合二抗后，選用化學(xué)發(fā)光法在凝膠成像儀上觀察各自條帶。

不同細(xì)胞表面蛋白mRNA 表達(dá)--細(xì)胞用PBS 清洗兩次后，提取RNA，濃度測(cè)定選用蛋白核酸分析儀，后續(xù)依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作。

免疫共沉淀--按照免疫共沉淀試劑盒說(shuō)明書(shū)流程操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用S P S S 1 8.0 軟件分析、處理，用t檢驗(yàn)計(jì)量資料（±s），P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

①卡巴膽堿逆轉(zhuǎn)天皰瘡棘層松解--尋常型天皰瘡組細(xì)胞碎片數(shù)目：（46.58±2.01）；正常組：（5.02±0.57）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，尋常型天皰瘡組Dsg3 和PG 均出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)聚集現(xiàn)象；②卡巴膽堿影響Dsg3 和PG 之間的相互作用--免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，HaCaT 細(xì)胞在PV-IgG 作用下，Dsg3 減少；加入卡巴膽堿后，Dsg3 恢復(fù)正常水平；③卡巴膽堿影響棘層松解相關(guān)信號(hào)分子磷酸化水平--HaCaT 細(xì)胞p38MAPK 在PV-IgG作用下與EGFR 發(fā)生磷酸化；加入卡巴膽堿后，p38MAPK 水平未變化，抑制EGFR 的磷酸化；④卡巴膽堿影響橋粒分子mRNA 水平的表達(dá)。

3 討論

天皰瘡屬于自身免疫性皮膚病，以正常皮膚或黏膜上出現(xiàn)松弛性水皰為主要表現(xiàn)，尼氏征陽(yáng)性，若不針對(duì)此類臨床癥狀采取及時(shí)有效的措施，不但會(huì)造成皮膚損傷，還可能引起精神障礙、發(fā)熱等全身性癥狀，嚴(yán)重影響天皰瘡患者的日常生活水平和質(zhì)量。在構(gòu)建的天皰瘡細(xì)胞模型中加入卡巴膽堿，橋粒蛋白染色模式和細(xì)胞解離發(fā)生逆轉(zhuǎn)，證實(shí)卡巴膽堿對(duì)棘層松解有逆轉(zhuǎn)作用，同時(shí)卡巴膽堿還可增加Dsg3 的熒光強(qiáng)度[8-10]。構(gòu)建模型中的Dsg3 和PG 這兩項(xiàng)指標(biāo)的總蛋白量一直在下降，由此可知，蛋白總量和表達(dá)水平下降不存在聯(lián)系，反而可能是蛋白內(nèi)化降解導(dǎo)致。由本次研究實(shí)驗(yàn)可得，在構(gòu)建模型中加入卡巴膽堿，模型中的各種變化都在逆轉(zhuǎn)，可穩(wěn)定橋粒結(jié)構(gòu)；卡巴膽堿可抑制EGFR 磷酸化，但不會(huì)對(duì)p38MAPK 磷酸化產(chǎn)生影響，這說(shuō)明較下游信號(hào)途徑是卡巴膽堿的作用之處，進(jìn)而抑制棘層松解。本次研究對(duì)天皰瘡棘層松解的相關(guān)情況進(jìn)行相關(guān)性的探究，依據(jù)研究結(jié)果可知，尋常型天皰瘡組在細(xì)胞解離實(shí)驗(yàn)中顯示細(xì)胞碎片數(shù)目為（46.58±2.01）；棘層松解相關(guān)信號(hào)分子磷酸化水平，Dsg3 和PG 間的相互作用和橋粒分子mRNA 水平的表達(dá)三項(xiàng)水平或相關(guān)作用效果均受卡巴膽堿的影響。

綜上所述，天皰瘡棘層松解選用膽堿能受體可呈現(xiàn)一定的逆轉(zhuǎn)作用，相應(yīng)逆轉(zhuǎn)機(jī)制包括--加強(qiáng)PG 和Dsg3 的相互作用；抑制前兩項(xiàng)指標(biāo)的內(nèi)化加強(qiáng)表達(dá)；抑制棘層松解EGFR的磷酸化。