四氯化碳溶液構(gòu)建肝纖維化大鼠模型研究進(jìn)展*

蔡碧蓮，文亦磊，羅偉生△

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)（南寧530001）；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（南寧530023）

肝纖維化是指肝臟在受到各種因素，如生物、化學(xué)、物理等因素的損傷作用下，細(xì)胞外基質(zhì)異常合成增多與降解不足所引起的病理過程。當(dāng)這一病理過程持續(xù)發(fā)展，肝小葉的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)現(xiàn)改變，隨之而來的是結(jié)節(jié)及假小葉的形成，最終會(huì)發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。因此，在“肝炎-肝硬化-肝癌”這三個(gè)環(huán)節(jié)中，肝纖維化起著非常關(guān)鍵的作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1］，治療肝纖維化的有效方法為清除病毒、減少致病因素對(duì)肝細(xì)胞的損傷，從而恢復(fù)肝臟正常結(jié)構(gòu)和功能。研究表明［2］，在肝臟受到輕度損傷的情況下，若積極治療和調(diào)護(hù)，肝纖維化是可逆的。大鼠肝纖維模型的建立，是研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制、發(fā)生發(fā)展病理過程的首要前提，也是為臨床研究中醫(yī)藥防治肝纖維化的基礎(chǔ)。

1 四氯化碳對(duì)肝損傷的作用機(jī)制

四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl4），別名四氯甲烷，是一種極易揮發(fā)且會(huì)使人產(chǎn)生愉悅感的無色透明液體。與水互不相溶，但在某些有機(jī)溶劑中有較好的溶解性，如脂肪、油類等?？捎煽诒?、咽喉、食道和皮膚吸收。正是因?yàn)樗蓪?duì)肝臟產(chǎn)生毒性作用，使肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生改變，甚至引起肝細(xì)胞凋亡壞死。因此作為誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型，它是最為常用的化學(xué)溶劑［3］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［4］，CCl4屬于自由基毒理學(xué)-肝毒物作用機(jī)制中的直接肝毒物，其作用原理:①CCl4直接作用于細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜，引起膜脂質(zhì)發(fā)生過度氧化、膜蛋白發(fā)生變性、膜結(jié)構(gòu)遭到損傷，從而使肝細(xì)胞壞死。②CCl4穿透過線粒體膜，隨后線粒體膜發(fā)生腫脹變形后導(dǎo)致脂肪酸β一氧化碳降低，由于脂肪酸得不到氧化作用，則會(huì)轉(zhuǎn)化為甘油三酯，脂類物質(zhì)沉積在細(xì)胞質(zhì)之中，從而引起細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。③在細(xì)胞色素酶P4502E1（CYP2E1）的誘導(dǎo)作用下的CCl4降解為CCl3—，引起肝小葉中央?yún)^(qū)的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死，與此同時(shí)吞噬細(xì)胞和炎性細(xì)胞清除壞死區(qū)域，肝星形細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞，促進(jìn)纖維化的發(fā)生。

2 構(gòu)建肝纖維化大鼠模型與皮下注射四氯化碳的時(shí)間和劑量

根據(jù)藥理學(xué)和代謝學(xué)的研究［5］，CCl4進(jìn)入大鼠體內(nèi)2 h后，肝功能指標(biāo)會(huì)明顯升高直至24 h 后達(dá)到最大值，而后降低，至72 h后恢復(fù)正常。基于這一代謝原理，2次／周進(jìn)行肝纖維化模型構(gòu)建被許多實(shí)驗(yàn)者所采納。根據(jù)CCl4的毒性藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)［6］，在一次皮下注射建模過程中，肝臟受到損傷的過程是發(fā)生在第6、24小時(shí)，而肝臟修復(fù)的階段是在第48小時(shí)至2周，在12周內(nèi)則會(huì)引起肝纖維化形成。因此，8～10周是常規(guī)構(gòu)建肝纖維化大鼠模型的周期。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)者都選用橄欖油、花生油等油脂溶液溶解CCl4?？诜⑽?、皮下注射、腹腔注射［7］是目前實(shí)驗(yàn)者經(jīng)常選擇的造模方式。有實(shí)驗(yàn)研究表明［8］，考慮給藥途徑、時(shí)間和劑量的不同，肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)也不同，模型建成的周期亦不同，但在第6～9周時(shí)，基本可見纖維化形成。王曉紅等［9］采用劑量為0.3 ml／100 g的50%CCl4植物油溶液皮下注射大鼠，2次／周，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟炎癥和纖維組織增生程度，與實(shí)驗(yàn)周期有關(guān)。20周后，大鼠正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，纖維組織增生，可伴有纖維橋連，或形成假小葉。

3 構(gòu)建肝纖維化大鼠模型與四氯化碳注射方式的選擇

有研究發(fā)現(xiàn)［10］，腹腔注射CCl4后檢測(cè)生化指標(biāo)，4～6 h后血清ALT、AST 值較前升高至5～6倍，在24 h后開始下降，提示腹腔注射CCl4的吸收速度快。腹腔注射CCl4常發(fā)生皮膚潰爛，而且其導(dǎo)致的死亡率也明顯高于皮下注射［11］。因此，雖然腹腔注射比皮下注射吸收速度快，但若是實(shí)驗(yàn)者操作不夠嫻熟，可能誤將CCl4注射至腹腔內(nèi)的其他臟器，反而會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。綜合考慮到以上各種情況，從大鼠的存活率、死亡率、成模率等因素來分析，在注射方式的選擇上，通過皮下注射CCl4進(jìn)行肝纖維化大鼠造模，其存活率、成模率比腹腔注射高，而死亡率比腹腔注射低。這樣一來，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加可信，也縮短了總的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并且能減少不必要的實(shí)驗(yàn)消耗。

4 注射方式與大鼠一般情況

安禎祥等［12］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)建模型前，各組大鼠的體質(zhì)量差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在構(gòu)建肝纖維化大鼠模型過程中，發(fā)現(xiàn)腹腔注射造模組大鼠一般情況較差，精神不振，反應(yīng)遲鈍，行為遲緩，納差，皮毛枯燥無光澤，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與之相反的皮下注射造模組一般情況較好，精神可，反應(yīng)較靈敏，行為激進(jìn)，食量較多，體質(zhì)量有增長(zhǎng)的幅度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。造成此差異的原因可能是注射CCl4后大鼠肝臟細(xì)胞發(fā)生炎癥或壞死凋亡，進(jìn)而引起形態(tài)、行為上的改變。張磊等［13］研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射50%CCl4混合溶液，在用藥第6周后，大鼠的一般情況逐漸好轉(zhuǎn)，考慮可能與大鼠對(duì)CCl4混合溶液毒性藥物產(chǎn)生的耐受相關(guān)。從大鼠的一般情況進(jìn)行考量，皮下注射的造模方式優(yōu)于腹腔注射。

5 皮下注射四氯化碳與肝纖維化檢測(cè)指標(biāo)

在建模第10 周后，取腹主動(dòng)脈血，檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、III型前膠原（PCⅢ）、IV 型膠原（IV-C）、層粘連蛋白（LN）及透明質(zhì)酸酶（HA）含量，切取肝組織做病理學(xué)檢查，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）及Masson染色，病理觀察。按照《病毒性肝炎防治方案》［14］，通過顯微鏡觀察肝細(xì)胞炎癥及纖維化增生程度，以肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，直至肝纖維化分期達(dá)2期以上，即說明大鼠肝纖維化模型構(gòu)建成功。陳剛等［15］通過實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，上述大鼠血清學(xué)指標(biāo)與肝纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系。換言之，大鼠肝纖維化程度越嚴(yán)重，則其血清學(xué)指標(biāo)也會(huì)呈遞增趨勢(shì)。在病理切片中顯示早期肝硬化（S4期）的時(shí)候，血清指標(biāo)呈遞增趨勢(shì)，肝功能和肝組織損傷程度也隨之加重?？紤]這些血清指標(biāo)可能是細(xì)胞外基質(zhì)沉積與降解的綜合反映。由于細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用尚未降低，內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)功能尚未受到破壞，所以在S1～S2期血清指標(biāo)上升幅度較小。同理推測(cè)，S3、S4期的血清指標(biāo)會(huì)出現(xiàn)明顯上升，是因?yàn)榧?xì)胞外基質(zhì)合成出現(xiàn)異常，內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解也出現(xiàn)異常。雖然兩者有一定的聯(lián)系性，但上述血清指標(biāo)并不能準(zhǔn)確區(qū)分S1、S2、S3、S4期的肝纖維化程度。但其中，有幾項(xiàng)數(shù)值的變化，可推測(cè)注射CCl4后大鼠肝臟的改變。如:AST 數(shù)值的升高，反映了肝細(xì)胞線粒體受到一定程度的損傷；ALT 數(shù)值的升高，則是反映肝臟合成功能受到一定的破壞。

6 停止四氯化碳注射與大鼠肝纖維化的發(fā)展趨勢(shì)

有研究發(fā)現(xiàn)［16］，停止注射CCl4的大鼠，其肝纖維化有自愈的趨勢(shì)。還有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［17］，造模到達(dá)肝纖維化后，大鼠行為狀態(tài)并未出現(xiàn)明顯的變化，也沒有明顯的肝硬化癥狀（腹水、肝功能異常），但停止注射CCl4一段時(shí)間后，通過解剖大鼠腹腔，僅見少許腹水等肝功能失代償?shù)谋憩F(xiàn)。出現(xiàn)嚴(yán)重的肝纖維化甚至肝硬化，可能是因?yàn)镃Cl4注射劑量過多或者建模周期過長(zhǎng)所導(dǎo)致。

7 構(gòu)建大鼠肝纖維化過程中大鼠死亡的原因

在構(gòu)建大鼠肝纖維化模型過程中，大鼠的死亡是不可避免的，若是死亡率過高，則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差，從而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。所以分析并總結(jié)大鼠死亡原因在所難免。原因如下:①若是在建模過程中，由于操作不當(dāng)，原本是皮下注射卻不慎將CCl4注入血管使CCl4進(jìn)入血液循環(huán)，引起急性中毒，大鼠會(huì)在數(shù)分鐘后出現(xiàn)死亡。②未按照相應(yīng)體重注射相應(yīng)劑量的CCl4，導(dǎo)致輸入劑量過大，或CCl4濃度過高，也可引起大鼠死亡。③因個(gè)體的差異，耐受力的不同，在24 h后肝臟損傷達(dá)到高峰期，若大鼠發(fā)生急性肝衰竭，在2～3 d也會(huì)出現(xiàn)死亡。④因CCl4是有毒溶劑，注射創(chuàng)口易發(fā)生潰爛，甚至傷及至腹膜或腹腔臟器，從而引起大鼠感染致死。⑤注射CCl4導(dǎo)致大鼠性情改變，發(fā)生撕咬行為，也會(huì)致使大鼠感染而亡。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)及時(shí)總結(jié)分析大鼠死亡原因，盡量避免在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中再出現(xiàn)大批量的死亡，為實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性打下良好的基礎(chǔ)。

8 前景與展望

是否能成功地構(gòu)建大鼠肝纖維化模型是研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制、發(fā)病經(jīng)過及如何治療肝纖維化的重要前提條件。實(shí)驗(yàn)者通過以下方法，構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，如:運(yùn)用刀豆素A［18］，膽 管結(jié) 扎 術(shù)［19-20］，注 射 豬 血 清 或 人 血 白 蛋 白［21-22］，血 吸蟲［23］，酒精［24］、四氯化碳［25］，這些實(shí)驗(yàn)方式，分別會(huì)引起免疫性肝損害，膽汁郁積，自身免疫性肝纖維化，感染，中毒性肝損害，從而形成肝纖維化模型。CCl4所構(gòu)建的肝纖維化動(dòng)物模型是這些方法中造價(jià)成本相對(duì)低廉且實(shí)施方法相對(duì)簡(jiǎn)易，并且是最經(jīng)典、最早、運(yùn)用最廣泛、也最受實(shí)驗(yàn)者和研究者鐘愛的方法之一。其中皮下注射CCl4進(jìn)行造模，操作簡(jiǎn)易，大鼠死亡率低，成模率高，與自然生活環(huán)境更貼近，便于研究抗肝纖維化作用機(jī)制，因而更廣泛應(yīng)用。但由于CCl4是有毒溶劑，又因造模周期長(zhǎng)，在用藥時(shí)要注意中毒劑量和觀察大鼠活動(dòng)狀態(tài)，也因CCl4有自愈趨勢(shì)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況隨時(shí)予以調(diào)整，這方面值得進(jìn)一步深入研究。