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    基于非病毒載體的mRNA疫苗遞送系統(tǒng)研究進(jìn)展

    2020-12-27 21:39:11左青婷熊文碧
    四川生理科學(xué)雜志 2020年3期
    關(guān)鍵詞:磷脂陽離子脂質(zhì)

    左青婷 熊文碧

    (1. 四川大學(xué)華西藥學(xué)院,四川 成都 610041;2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,四川 成都 610041)

    1 mRNA疫苗

    mRNA疫苗的概念起源于1989年,Vical公司成功將外源性mRNA裝載進(jìn)脂質(zhì)體納米粒中并轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞[1]。隨后的一系列研究進(jìn)一步證明外源性mRNA可以遞送入活體組織中并產(chǎn)生蛋白質(zhì),可治療性用于病人的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤或缺失[2]。除此之外,在二十世紀(jì)九十年代初,有研究表示mRNA可以遞送抗原信息引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)[3]。在隨后的30年研究中,mRNA疫苗已經(jīng)到達(dá)了一個(gè)新的高度,許多候選藥物具有腫瘤治療和感染性疾病防治的應(yīng)用前景,已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。目前的mRNA疫苗主要包括非復(fù)制型(Non-replicating)mRNA疫苗和自我擴(kuò)增型(Self-amplifying) mRNA疫苗。

    1.1 非復(fù)制型mRNA疫苗

    非復(fù)制型mRNA疫苗通過線性pDNA或PCR模板的體外轉(zhuǎn)錄合成,主要結(jié)構(gòu)包括5'帽子結(jié)構(gòu)(Cap)、5'非翻譯區(qū)(Untranslated region,UTR)、開放閱讀框(Open reading frame,ORF)、3'非翻譯區(qū)和多聚腺苷酸尾巴〔Poly(A)〕。5'-UTR和3'-UTR中的調(diào)節(jié)元件可以調(diào)控mRNA的翻譯過程。ORF是含有編碼蛋白質(zhì)的核酸序列。5`帽子可以防止mRNA被外切酶迅速降解;防止天然免疫傳感器的識別;與真核翻譯啟動因子結(jié)合[4]。Poly(A)尾巴通過多聚腺苷酸結(jié)合蛋白(Poly A binding protein,PABP)連接帽子和尾巴,增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性[5]。

    1.2 自我擴(kuò)增型mRNA疫苗

    自我擴(kuò)增型mRNA是將編碼抗原的核酸序列直接插入單鏈RNA病毒中,其中編碼mRNA復(fù)制機(jī)制的基因是完整的,只是編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因被目的基因替換[6]。和非復(fù)制性mRNA相比,自我擴(kuò)增型mRNA有兩個(gè)優(yōu)勢:自我復(fù)制能力使目標(biāo)抗原在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá);mRNA表達(dá)時(shí)間增長,如非免疫源性報(bào)告蛋白可以在體內(nèi)持續(xù)兩個(gè)月的表達(dá)[7]。

    mRNA疫苗相比于DNA疫苗更加安全,不會導(dǎo)致治療性基因整合突變,并且能成功激活體內(nèi)的免疫應(yīng)答。此外,一種新的mRNA結(jié)構(gòu)通??梢砸砸环N直接、快速的方式合成,這一特點(diǎn)使mRNA疫苗在面對傳染性疾病如流感時(shí)成為理想的候選藥物。但是,為了保證mRNA疫苗在體內(nèi)的穩(wěn)定性與安全性,還需要合適的載體材料。mRNA疫苗的載體材料分為病毒載體和非病毒載體。本綜述主要討論用于遞送mRNA的非病毒載體的種類及研究進(jìn)展。

    2 遞送mRNA疫苗的非病毒載體材料

    2.1 陽離子脂質(zhì)

    脂質(zhì)體是由單層或多層磷脂雙分子組成的球形囊泡,囊泡內(nèi)為含有靶基因的水性核心。通常使用含有極性頭部基團(tuán)和非極性尾部的材料制備,這些基團(tuán)之間的疏水和親水相互作用刺激囊泡形成。帶正電的陽離子脂質(zhì)可以與帶負(fù)電的mRNA相互作用,從而達(dá)到遞送目的。但由于早期使用的陽離子脂質(zhì)在生理?xiàng)l件下也帶正電,既容易與生物流體中其他帶負(fù)電的分子相互作用,又容易被免疫細(xì)胞捕獲。因此,PH響應(yīng)的陽離子脂質(zhì)被篩選出,并被制備成多種形式的mRNA的遞送載體。

    脂質(zhì)納米粒(Lipid nanoparticle,LNP)是其中研究較多、較成熟的一種。LNP是由脂質(zhì)形成的、具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡。組成脂質(zhì)雙層殼的材料有可電離脂質(zhì)、磷脂、膽固醇、聚乙二醇化脂質(zhì),每種脂質(zhì)都發(fā)揮著不同的功能。含有胺基的脂質(zhì)或類脂類,如Dlin-MC3-DMA、G0-C14、C12-200是可電離脂質(zhì),有著合適的pKa,在較低的PH條件下帶正電,在生理?xiàng)l件下呈中性,這樣既減少了非特異性脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用,又可幫助mRNA實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸。組成LNP的磷脂(二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿),膽固醇,聚乙二醇(PEG)化脂質(zhì)(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-PEG、二肉豆蔻?;字R掖及?PEG)則有提高雙層膜的穩(wěn)定性,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)攝取等作用。

    正電中心的結(jié)構(gòu)、尾巴的長度、尾巴的幾何結(jié)構(gòu)以及連接鏈的長度等都會影響到LNP的效價(jià)。Anderson[8]等通過烯基環(huán)氧化合物與多胺核之間的開環(huán)反應(yīng)合成具有烯基氨基醇類的可電離脂質(zhì)(OF-00、OF-01、OF-02、OF-03)。脂質(zhì)與膽固醇、1,2-二醇基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、C14-PEG-2000以及未修飾的編碼人紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)的mRNA配制成LNP,以cKK-E12[9]為陽性對照,進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的比較。OF-02 LNPs的EPO血清濃度遠(yuǎn)高于cKK-E12 LNPs的EPO血清濃度。此外,在進(jìn)行量效曲線對比時(shí),OF-02 LNPs優(yōu)于cKK-E12 LNPs,前者在2.25 mg?kg-1劑量時(shí)達(dá)到了最大EPO濃度25400±5300 ng·ml-1。cKK-E12和OF-02的正電中心均為雙賴氨酸衍生的二酮哌嗪,區(qū)別在于前者的尾巴為氨基醇類脂質(zhì),后者連接的是碳十六二烯烴。除此之外,適當(dāng)增加連接鏈長度、加入載脂蛋白E等也能提高mRNA的轉(zhuǎn)染效率[10]。

    除了脂質(zhì)納米粒外,陽離子脂質(zhì)還會被制備成陽離子納米乳(Cationic nanoemulsion,CNE)用于提高mRNA疫苗在體內(nèi)的穩(wěn)定性。Brito[11]的研究團(tuán)隊(duì)使用陽離子脂質(zhì)(2, 3-二油?;?丙基)-三甲胺和乳液佐劑MF59制備陽離子納米乳。該CNE在小鼠體內(nèi)遞送編碼呼吸道合胞病毒融合糖蛋白的mRNA,在新西蘭白兔體內(nèi)遞送編碼HIV gp140包膜糖蛋白的mRNA,在非人類靈長動物體內(nèi)遞送編碼人巨細(xì)胞病毒包膜糖蛋白B的mRNA。這些mRNA在體內(nèi)都表現(xiàn)出良好的免疫原性。

    2.2 多聚物

    自1987年多聚賴氨酸(Polylysine,PLL)被報(bào)道作為首個(gè)陽離子多聚物非病毒載體成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA后,精胺、聚乙烯亞胺、殼聚糖、聚胺基脂等多聚物類非病毒載體相繼問世。

    聚氨基脂〔Poly(b-amino)ester,PBAE〕是一類聚胺類陽離子聚合物,通常由兩步反應(yīng)生成。第一步為胺與二丙烯酸酯通過邁克爾加成聚合,第二步用二元胺進(jìn)行末端封閉。核心胺除了親水性胺類,也會有親脂性胺類,比如C12烷基胺,以提高PBAE的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。PBAE的可降解性、高轉(zhuǎn)染效率和合成路徑簡單使PBAE十分具有前景,在早期被成功用于DNA的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染[12]。隨后研究人員對PBAE進(jìn)行修飾,成功在體內(nèi)完成mRNA的遞送。Anderson[13-14]等人以7mol%聚乙二醇-脂質(zhì)(PEG-lipid)修飾PBAE,提高其在體外的血清穩(wěn)定性,并通過靜脈注射成功將mRNA遞送到小鼠的肺中。轉(zhuǎn)染效率高的PBAE甚者超過了商業(yè)使用的jetPEI的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。需要注意的是,PEG-lipid修飾與體外血清穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率并非完全呈正相關(guān),優(yōu)化程度取決于原PBAE的化學(xué)結(jié)構(gòu),并且體外血清穩(wěn)定性并不是唯一的指標(biāo),它更適合作為療效篩選后的二級標(biāo)準(zhǔn)。隨后的兩年,Anderson[15]等人再次用聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone,PCL)修飾PBAE,完成了mRNA到脾臟的高效遞送,打開了用生物可降解載體遞送編碼抗原的mRNA的可能性。研究人員對傳統(tǒng)二丙烯酸酯進(jìn)行改造或?qū)郯被M(jìn)行整體修飾,使PBAE更多功能化、更低毒性、更高效。

    聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)也是一種非常有前景的陽離子多聚物遞送載體,最初作為非病毒載體遞送DNA進(jìn)入小鼠大腦[16]。PEI豐富的仲胺、叔胺基團(tuán)在一定PH條件下呈正電性,具有高密度電荷和緩沖能力。同時(shí),以上特有的理化性質(zhì)讓PEI有獨(dú)特的方式保護(hù)核酸免于溶酶體降解[17]。雖然PEI作為基因遞送載體有其獨(dú)特的優(yōu)勢,但其嚴(yán)重的細(xì)胞毒性限制了應(yīng)用。隨著PEI分子量的增加,雖然轉(zhuǎn)染效率提高,但毒性也隨之增大。為了克服限制,研究人員對PEI進(jìn)行了各種結(jié)構(gòu)的改造與修飾,如用多糖、聚乙二醇修飾PEI以提高生物相容性和轉(zhuǎn)染效率,用陰離子脂質(zhì)體或中性脂質(zhì)體包裹PEI/核酸聚合物,可以減少聚合物的非特異性粘附。此外,研究人員還通過制備低分子量PEI衍生物,在保證其低細(xì)胞毒性的同時(shí)提高轉(zhuǎn)染效率。

    2.3 樹形分子及其衍生物

    聚酰胺-胺(Polyamidoamine,PAMAM)和聚丙烯亞胺(Polypropyleneimine,PPI)是研究最廣泛的兩類樹形分子。在結(jié)構(gòu)上,樹形分子一般具有規(guī)整的分子結(jié)構(gòu),高度支化的分子內(nèi)有許多空腔,末端含有豐富的官能團(tuán)。Chahal[18]等人開發(fā)一個(gè)快速反應(yīng),完全合成,單一劑量,無需佐劑的樹狀大分子納米粒子疫苗平臺,以更好應(yīng)對突發(fā)疫情,持續(xù)發(fā)展的病原體以及特殊需求的病人。可電離的樹狀大分子納米材料結(jié)合上PEG修飾的脂質(zhì),最后包封mRNA復(fù)制子得到疫苗。疫苗通過肌內(nèi)注射可以檢測到相應(yīng)RNA的成功表達(dá)以及抗原特定T細(xì)胞的激活。在另一份報(bào)道中,Siegwart[19]等人從可以有效遞送siRNA/miRNA到肝臟的樹狀大分子脂質(zhì)納米粒(Dendrimer lipid nanoparticle,DLNP)中得到靈感,設(shè)計(jì)出一種優(yōu)化的DLNP,用于遞送編碼延胡索酸水解酶的mRNA。使用優(yōu)化的DLNP,在低劑量mRNA下,>44%的肝細(xì)胞可以被轉(zhuǎn)染并且高產(chǎn)延胡索二酰乙酰乙酸水解酶蛋白。

    2.4 細(xì)胞穿透肽

    細(xì)胞穿透肽(Cell-penetrating peptide,CPP)發(fā)現(xiàn)于1988年,是一種短序列多肽,能幫助細(xì)胞攝取多種分子。Frankel和Pabo的研究[20]表明HIV-1的反轉(zhuǎn)錄激活因子(Trans-activator of transcription,Tat)能進(jìn)入組織培養(yǎng)中的細(xì)胞,并最終定位于細(xì)胞核;1990年P(guān)rochiantz[21]等人根據(jù)果蠅同源異型觸角基因的序列合成了有60個(gè)氨基酸的多肽(pAntp)。該多肽不僅可以進(jìn)入哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)元分化,還可以增強(qiáng)已分化神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變。雖然CPP的跨膜機(jī)制仍不清楚,但人工合成設(shè)計(jì)CPP的大門已經(jīng)開啟。CPP具有低毒性和無細(xì)胞限制的優(yōu)勢,已被用于成功遞送寡肽、蛋白質(zhì)、pDNA等。

    目前,CPP在mRNA遞送領(lǐng)域的研究相對較少,但依舊具有較大潛力。Koker[22]研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種具有雙親性RALA基序的CPP,可以將編碼抗原的mRNA遞送到免疫系統(tǒng)。在酸性條件下,該細(xì)胞穿透肽帶有低密度正電荷,雙親性的RALA基序也幫助包裹mRNA進(jìn)入胞漿,編碼抗原,促進(jìn)CD8 T細(xì)胞分化。此外,該研究團(tuán)隊(duì)還嘗試將修飾的mRNA(假尿苷和5-甲基胞苷修飾的mRNA)與CPP聯(lián)合。修飾后的mRNA在促進(jìn)T細(xì)胞分化方面得到提升,并且這種優(yōu)化只發(fā)生在CPP介導(dǎo)的載體,并不發(fā)生在以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的載體。

    2.5 其他

    最近,Wang[23]等以聚乙二醇-聚乙丙交酯嵌段聚合物為主要原料,輔以陽離子脂質(zhì)BHEMChol,制備陽離子脂質(zhì)-聚合物雜化納米顆粒(Cationic lipid-assisted nanoparticle,CLAN)。CLAN能將Cas9 mRNA和引導(dǎo)RNA(guide RNA,gRNA)遞送入巨噬細(xì)胞,用于治療NLRP3依賴的炎癥性疾病。Hammond[24]等人通過將多聚腺苷酸結(jié)合蛋白(Poly A binding protein,PABP)與mRNA協(xié)同組裝以提高mRNA在小鼠體內(nèi)的表達(dá)。

    3 結(jié)語

    相比于傳統(tǒng)疫苗,mRNA疫苗可應(yīng)對多種新型病毒,甚至癌癥。為了將mRNA疫苗更好地應(yīng)用于臨床,研究人員聚焦于增強(qiáng)mRNA疫苗的穩(wěn)定性、降低其免疫原性、優(yōu)化和完善其遞送系統(tǒng)。以往的遞送載體開發(fā)進(jìn)程慢,現(xiàn)在研究人員會利用計(jì)算機(jī),采用可控的開環(huán)反應(yīng)、平行合成等方法在短時(shí)間內(nèi)合成大量遞送載體,再通過有效的篩選技術(shù)得到轉(zhuǎn)染效率高的遞送載體,大大節(jié)約了時(shí)間和成本[25]。但目前實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)室到臨床試驗(yàn)的mRNA疫苗只有一小部分。遞送載體的穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性、包封率等問題還有待解決。為了研發(fā)出符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范要求、能最終應(yīng)用于臨床的mRNA疫苗,基因遞送材料尤其是非病毒遞送材料領(lǐng)域仍待更深的開拓。

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