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    舟山海域常見經(jīng)濟物種組氨酸二肽的提取和鑒定

    2020-12-26 10:12:32王春月李艷榮黃莉莉李煒男嚴小軍
    關鍵詞:二肽肌肽組氨酸

    王春月,李艷榮,潘 晨,黃莉莉,李煒男,陳 建,廖 智,嚴小軍

    (1.浙江海洋大學海洋科學與技術學院,海洋生物蛋白質(zhì)工程實驗室,浙江舟山 316022;2.寧波海洋研究院,浙江寧波 315800)

    組氨酸二肽(Histidine-containing dipeptide)是廣泛分布于生物體內(nèi)且具有重要生理活性的一類小分子肽,其主要成員包括肌肽(Carnosine,Car,β-alanyl-L-histidine,C9H14N4O3)、鵝肌肽(Anserine,Ans,βalanyl-L-1-methylhistidine,C10H16N4O3)、鯨肌肽 (Ophidine/Balenine,β-alanyl-L-3-methylhistidine,C10H16N4O3)、高肌肽(Homocarnosine,Hcar,γ-amino-butyryl-histidine,C10H16N4O3)、N-乙酰肌肽(Acetyl-carnosine,C11H16N4O4) 等[1]。早在1900 年,俄羅斯化學家GULEWITCH,et al[2]在牛肉類提取物中首次發(fā)現(xiàn)肌肽。隨后,一系列肌肽同系物被發(fā)現(xiàn),由于肌肽及其同系物中均含有組氨酸殘基,因此,這一類二肽被統(tǒng)稱為組氨酸二肽[3-6]。組氨酸二肽在生物體內(nèi)具有多種生理活性,已報道的包括酸堿平衡[7]、自由基清除[7]、金屬螯合離子[8]、抗氧化[9-10]、抗痛風[11]等活性;此外,組氨酸二肽在糖尿病[12-13]、心血管疾病[14]、解毒[15]、神經(jīng)醫(yī)學[16]、營養(yǎng)學等領域也具有重要的應用價值。因此,對生物體內(nèi)組氨酸二肽的研究一方面有助于了解該物種的營養(yǎng)價值;另一方面也有助于從中開發(fā)組氨酸二肽為來源的各類特殊食品和保健品。

    目前市場上銷售的組氨酸二肽制品主要來源包括化學合成和天然生物提取。其中化學合成法生產(chǎn)的組氨酸二肽由于生產(chǎn)過程中很難避免化學污染,且成本較高,因而限制了其應用[17];而生物體內(nèi)組氨酸二肽的提取主要來源于金槍魚、鰹魚和鮪魚等深海魚類的肌肉組織,但這些深海魚存在捕撈難、價格貴等缺點,同樣限制了組氨酸二肽的生產(chǎn)和應用。組氨酸二肽主要存在于動物肌肉以及神經(jīng)組織,特別是在畜禽類[18]、哺乳動物類[19]以及部分高經(jīng)濟價值洄游性魚類肌肉中[20],組氨酸二肽的研究較為深入。但整體而言,目前對水產(chǎn)類經(jīng)濟物種的組氨酸二肽相關研究尚不多見。

    舟山海域作為我國最大的漁場,海洋漁業(yè)資源豐富。為進一步了解舟山海域常見經(jīng)濟物種體內(nèi)組氨酸二肽的含量,選擇35 種舟山海域常見經(jīng)濟水產(chǎn)物種以及金槍魚、鰹魚和三文魚;同時,采用雞胸肉組織作為參照。首先通過超濾法開展肌肉組織中組氨酸二肽的提取,之后采用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)顯色法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-NS/MS)兩種方法對組氨酸二肽總量及不同同系物進行定量分析和比較;進一步采用經(jīng)典的DPPH 法對上述物種的組氨酸二肽提取物開展了抗氧化活性分析。研究結果表明,舟山海域常見經(jīng)濟物種的肌肉組織中,多數(shù)均含有組氨酸二肽類物質(zhì),但組成成分存在差別;同時,發(fā)現(xiàn)顯色法和液-質(zhì)聯(lián)用法對組氨酸二肽的定量分析結果在部分物種中存在差異。不同物種的組氨酸二肽提取物的抗氧化活性也存在明顯差異。上述研究結果為深入了解舟山海域常見經(jīng)濟物種的營養(yǎng)價值,以及開發(fā)組氨酸二肽為來源的特殊食品和保健品提供了科學依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 樣品采集

    35 種舟山海域常見經(jīng)濟物種主要采自舟山市嵊泗群島海域或購自舟山市沈家門東河菜場,并經(jīng)形態(tài)學鑒定確定其物種學名(表1);金槍魚、鰹魚和三文魚購自浙江大洋世家股份有限公司;其中,硬骨魚類26種,甲殼類7 種,軟體動物類6 種。雞胸肉(作為參照組)采自舟山本地飼養(yǎng)的三黃雞。

    表1 所有樣品,學名及其采集地Tab.1 All samples,scientific names and collection locations

    1.2 組氨酸二肽的提取

    參照文獻[21]方法,對上述物種首先提取其新鮮肌肉組織,經(jīng)冷凍干燥充分脫水后,于肌肉干組織樣品中加入去離子水進行勻漿處理;之后經(jīng)冰浴超聲(4 ℃,10 min)。超聲處理后,對樣品進行離心(4 ℃,12 000 g,15 min)。取上清液備用。沉淀部分繼續(xù)加入1 mL 去離子水攪拌均勻,再經(jīng)勻漿、超聲、離心提取2 次;將3次所得上清液混合,以0.22 μm 水相濾膜過濾;之后進行超濾(截留分子量3 kD),收集濾過液冷凍干燥后待測。

    1.3 鄰苯二甲醛法測定肌肽和鵝肌肽含量

    首先采用鄰苯二甲醛(o-Phthalaldehyde,OPA)法[22]對樣品中的組氨酸二肽進行檢測。取待測樣品10 μL,加入10 μL 三氯醋酸(TCA)加入20 μL 1 moL·L-1的NaOH,5 min 后加入20 μL 1%的OPA,1 min 后加入20 μL 1 moL·L-1的HCl。30 min 后測定630 nm 處吸光值(OD630)。肌肽,鵝肌肽標準品由上海強耀公司采用固相化學合成法合成。預先配制濃度分別為226、113、56.5、28.25、14.13、7.06、3.53 和1.7 μg·mL-1的肌肽標準品溶液和濃度分別為240、120、60、30、15、7.5、3.75 和1.88 μg·mL-1的鵝肌肽標準品溶液,按照上述方法測定吸光值,繪制標準曲線。

    1.4 液質(zhì)聯(lián)用法測定肌肽、鵝肌肽和高肌肽含量

    采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS,賽默飛世爾科技公司)開展分析。取待測樣品與乙腈1:1 混合后上樣液-質(zhì)聯(lián)用儀。色譜條件為:采用UltiMate 3000 液相色譜儀,色譜柱為Acquity UPLC BEH Amide(17 μm,waters),柱溫為35 ℃。流動相A 為乙腈/水(體積比3∶7),流動相B 為乙腈/水(體積比8∶2),為了促進離子化效果,A、B 流動相中均加入0.1% 氨水。洗脫時間為20 min,洗脫梯度為:0~10 min,100%~60% B;10~11 min,60%~40% B;11~11.5 min,40%~100% B;11.5~20 min,100% B。進樣量為3 μL,流速為0.15 mL·min-1。質(zhì)譜條件為:采用Q-Exactive 四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀,全掃描正離子模式下(質(zhì)量范圍:m/z 150~500),分辨率70 000,自動增益控制(AGC)目標值3e6;噴霧電壓為350 KV,離子傳輸管溫度為275 ℃,鞘氣壓30 arb,輔助氣壓10 arb,氣化室溫度350 ℃。在樣品運行前對儀器進行正離子校正。

    1.5 抗氧化實驗

    采用經(jīng)典的DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)法[23],檢測組氨酸二肽提取物的抗氧化活性。取上述物種肌肉組織組氨酸二肽提取物的凍干粉末樣品溶于去離子水,樣品終濃度為1 mg·mL-1;以無水乙醇做參比,于519 nm 波長下測吸光度。根據(jù)以下公式計算樣品對DPPH 自由基的清除率:清除率=(A0+A1-A2)/A0×100%;式中,A0 為對照組的吸光值;A1 為空白組的吸光值;A2 為實驗組的吸光值。對照組分別為維生素C、肌肽和鵝肌肽標準品,終濃度為1 mg·mL-1,按照相同的方法測得吸光值并與樣品組進行比較。

    2 結果

    2.1 OPA 法鑒定結果

    采用OPA 顯色法首先對肌肽,鵝肌肽標準品進行了標準曲線繪制,結果如圖1,由圖可見,肌肽和鵝肌肽2 種標準品對OPA 具有明顯的顯色反應且呈濃度依賴性,其回歸方程分別為y=0.014 15 x-0.031 04(肌肽)和y=0.013 89 x-0.005 54 (鵝肌肽);線性范圍分別為1.70~226 μg·mL-1(肌肽)和1.88~240 μg·mL-1;線性關系良好,R2值在0.999 以上。

    圖1 采用OPA 顯色法繪制的肌肽(A)與鵝肌肽(B)標準曲線Fig.1 The standard curves of carnosine (A) and carnosine (B) were drawn by OPA colorimetry

    OPA 法檢測結果如圖2。所有檢測物種肌肉組織中均可檢測出組氨酸二肽,其中雞胸肉含量最高,為28.07 μg·mg-1干組織,其次為厚殼貽貝(24.17 μg·mg-1)和秋刀魚(21.43 μg·mg-1)。在26 種魚類肌肉中,組氨酸二肽含量在4.21~21.43 μg·mg-1干組織間,不同魚類之間差異很大。在7 種甲殼類物種肌肉組織中,組氨酸二肽含量在4.81~8.66 μg·mg-1之間,其中哈氏仿對蝦組氨酸二肽含量最高;6 種軟體動物肌肉組織中,組氨酸二肽含量范圍在7.22~24.17 μg·mg-1之間。其中,厚殼貽貝的組氨酸二肽含量最高;2 種頭足類生物中,中國槍烏賊組氨酸二肽含量為9.37 μg·mg-1,曼氏無針烏賊組氨酸二肽含量為15.34 μg·mg-1。

    圖2 OPA 法鑒定不同物種的組氨酸二肽含量.Fig.2 The content of histidine-containing dipeptides in different species was determined by OPA method

    2.2 LC-MS 法鑒定結果

    考慮到組氨酸二肽含有不同的同系物,其中以肌肽,鵝肌肽和高肌肽最為常見,因此,進一步采用液-質(zhì)聯(lián)用法對上述物種肌肉組織中的組氨酸二肽的不同同系物進行分析。分別采用肌肽(分子量227.11)、鵝肌肽(分子量241.12)和高肌肽(分子量241.12)作為標準品。3 種組氨酸二肽標準品的二級質(zhì)譜鑒定結果如圖3,由圖3 可見,三種組氨酸二肽標準品的特征峰明顯,且與其母離子斷裂后的碎片峰質(zhì)量一致。

    圖3 組氨酸二肽標準品的二級質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectrum secondary mass spectrum of histidine-containing dipeptides standard

    所測39 個物種的3 種組氨酸二肽含量如圖4 所示。多數(shù)硬骨魚類的肌肉組織中均含有肌肽和鵝肌肽,且鵝肌肽含量顯著高于肌肽(P<0.05);僅少數(shù)物種,如帶魚Trichiurus lepturus,小黃魚Larimichthys polyactis,龍頭魚Harpadon nehereus、蛇鰻和日本鯖Scomber japonicus 肌肉組織中可鑒定到高肌肽的存在,且含量較低。此外,有14 個物種未能通過液-質(zhì)聯(lián)用法鑒定到組氨酸二肽,包括斑條躄魚Antennarius striatus、大彈涂魚Boleophthalmus pectinirostris、刺鯧Psenopsis anomala 3 種魚類以及軟體動物和甲殼類生物。

    所檢測物種中,雞胸肉的肌肽和鵝肌肽的總含量最高,其中肌肽含量為6.97 μg·mg-1;鵝肌肽含量為21.11 μg·mg-1;其次為金槍魚Thunnus tonggol(肌肽:0.014 μg·mg-1;鵝肌肽:7.06 μg·mg-1)、短尾大眼鯛Priacanthus macracanthus(肌肽0.02 μg·mg-1;鵝肌肽:4.13 μg·mg-1)、鰹魚Katsuwonus pelamis(肌肽:1.12 μg·mg-1;鵝肌肽:4.66 μg·mg-1)等。

    圖4 LC-MS 法鑒定的不同物種肌肉組織中肌肽、鵝肌肽和高肌肽含量Fig.4 The contents of carnosine,anserine and homocarnosine in muscle tissues of different species identified by LC-MS method

    2.3 DPPH 抗氧化實驗結果

    不同物種的組氨酸二肽提取物的DPPH 清除能力如圖5 所示,其中,作為對照組的維生素C(1 mg·mL-1)的清除率為74.00%;肌肽標準品(1 mg·mL-1)的清除率為17.18%;鵝肌肽標準品(1 mg·mL-1)的清除率為13.73%。多數(shù)物種的組氨酸二肽提取物在1 mg·mL-1濃度下都具有明顯的DPPH 清除能力,僅大黃魚Larimichthys crocea 和蛇鰻未能鑒定到DPPH 清除能力。多數(shù)物種的DPPH 清除能力顯著低于維生素C(P<0.05),但明顯高于肌肽和鵝肌肽標準品(P<0.05)。其中,銀鯧Pampus argenteus、銀姑魚Pennahia argentata 和厚殼貽貝Mytilus coruscus 的組氨酸二肽提取物具有較高的DPPH 清除率,分別為65.20%、63.52%和62.64%,僅次于維生素C。其次為雞胸肉54.38%和秋刀魚Cololabis saira 49.64%。

    圖5 不同物種組氨酸二肽提取物的DPPH 抗氧化實驗結果Fig.5 DPPH antioxidant results of histidine dipeptide extracts from different species

    3 討論

    目前,針對組氨酸二肽含量的研究主要集中在哺乳動物類。不同哺乳動物組氨酸二肽的含量差異極大,含量最高的為海洋哺乳動物,如藍鯨Balaenoptera musculus(組氨酸二肽含量12~14 μg·mg-1濕組織)[24],含量最低的為鼠(約0.24 μg·mg-1濕組織)[25]。魚類中,目前已知組氨酸二肽含量在金槍魚(屬于鱸形目旗魚科)肌肉組織中含量最高(約15 μg·mg-1濕組織),其次為鮭形目(4~10 μg·mg-1濕組織);而在鯉形目和鯡形目中,基本檢測不到組氨酸二肽[20,26];其他物種中,已知在鳥類(雁形目和雞形目)以及爬行動物(有鱗目)中含有較高的組氨酸二肽[27];但是在甲殼類動物和軟體動物中,關于組氨酸二肽含量研究尚未見報道。

    組氨酸二肽的含量測定目前已有包括顯色法,高效液相色譜法以及質(zhì)譜法等多種方法[28]。其中,利用OPA 試劑與組氨酸二肽發(fā)生顏色反應并用以定量檢測是最為簡便的方法,可鑒定組氨酸二肽的總含量。該方法由ALEKSANDER,et al[22]發(fā)明,其原理在于OPA 與組氨酸二肽反應可發(fā)生從磚紅色到紫色最終變?yōu)樗{色的顯色反應。利用該方法,對所39 個物種進行檢測,結果表明所測物種的肌肉組織中均含有不同濃度的組氨酸二肽,其濃度范圍介于4~28 μg·mg-1干組織之間。其中,本研究采用OPA 法測得的雞胸肉組織中組氨酸二肽含量(28.07 μg·mg-1)與PEIRETTI,et al[21]采用液-質(zhì)聯(lián)用法測得的雞胸肉中組氨酸二肽含量(25.30 μg·mg-1)基本一致,也與DU,et al[29]所測結果接近;同時,本研究進一步采用了液-質(zhì)聯(lián)用法測定雞胸肉組織中的組氨酸二肽含量,結果表明,雞胸肉組織中含有肌肽和鵝肌肽總量為28.08 μg·mg-1,與OPA 法所測數(shù)據(jù)無顯著差異(P>0.1)。上述結果表明,采用OPA 法檢測組氨酸二肽含量具有一定的可靠性。但從其他物種的檢測結果來看,兩種檢測方法(OPA 法和液-質(zhì)聯(lián)用法)所獲得的結果存在較大差異且無明顯相關性。除少數(shù)物種(如短尾大眼鯛Priacanthus macracanthus)外,采用OPA 法所測結果明顯比液-質(zhì)聯(lián)用法測定結果要高(約8.8 倍),這可能與OPA 法測定的是組氨酸二肽的總量,而液-質(zhì)聯(lián)用法測定的三種組氨酸二肽同系物的含量所導致。此外,考慮到OPA 法利用的是顯色反應,而動物肌肉組織中,除了組氨酸二肽,尚有其他物質(zhì),包括組氨酸二肽的組成單體(丙氨酸和組氨酸)以及亮氨酸等[22],也可能與OPA 試劑發(fā)生顏色反應從而干擾到測定結果。因此,液-質(zhì)聯(lián)用法相對于OPA 法,對組氨酸二肽進行測定具有更好的特異性和準確度;但OPA 法因其操作簡便,檢測成本較低,因此也可作為組氨酸二肽的粗略鑒定技術。

    目前,多數(shù)已報到的哺乳動物組氨酸二肽主要成分是肌肽,但是在魚類中,其主要成分為鵝肌肽,鳥類中同樣以鵝肌肽為主,而在蛇類和鯨類中則以鯨肌肽(蛇肌肽)為主[27]。從本研究結果來看,采用液-質(zhì)聯(lián)用法,在魚類和雞胸肉組織中,所測定的組氨酸二肽主要成分為鵝肌肽,肌肽含量平均僅為鵝肌肽含量的十分之一。部分魚類中僅檢測到鵝肌肽,而未能檢測到肌肽,如鯧魚,海鱸魚和鮸魚。高肌肽是肌肽的-丙氨酸被-氨基丁酸取代后的產(chǎn)物,目前研究尚不多見。在所檢測的物種中,僅少數(shù)物種含有高肌肽,包括帶魚,小黃魚,龍頭魚、蛇鰻和日本鯖肌肉組織。這表明高肌肽在所測魚類樣品中并非廣泛存在。但值得注意的是,在龍頭魚,蛇鰻和日本鯖中,僅檢測到高肌肽的存在,而未能檢測到肌肽與鵝肌肽的存在。這表明,魚類中,組氨酸二肽家族的不同成員在不同物種中的分布差異較大,推測可能與不同物種的生活習性和生理特征有關。

    目前,此前已有報道表明組氨酸二肽在生物體內(nèi)具有抗氧化活性。DPPH 清除率結果表明,所測物種的組氨酸二肽提取物均具有明顯的DPPH 清除能力,但該活性與組氨酸二肽的含量之間并無明顯的相關性。同時我們也注意到,多數(shù)物種的組氨酸二肽提取物在同等濃度下,其抗氧化活性要強于肌肽和鵝肌肽標準品。這可能是因為組氨酸二肽提取物中含有其他具有抗氧化活性的小分子物質(zhì)所導致。已知海洋生物中富含各種抗氧化活性物質(zhì),包括?;撬醄30],抗氧化肽[31],類胡蘿卜素(蝦青素)[32],以及部分脂肪酸分子[33]等。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn),甲殼類和軟體動物類,盡管未能在液-質(zhì)聯(lián)用法中檢測到組氨酸二肽的存在,但其提取物仍表現(xiàn)出較強的DPPH 清除率,表明上述物種中可能存在其他抗氧化活性的物質(zhì)。

    通過上述研究,對舟山海域常見的35 種水產(chǎn)物種進行了組氨酸二肽含量測定和提取物的抗氧化活性分析,為了解常見海洋生物的組氨酸二肽不同成員的含量以及基于該含量的營養(yǎng)價值判斷奠定了基礎。

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