養(yǎng)殖松江鱸鰻弧菌的分離鑒定及藥敏試驗

夏蘇東，尤宏爭，李 楠，郝 爽，尹 川，張 丹，張振國，呂 爽，仲 雷

(1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221)

松江鱸Trachidermus fasciatus Heckel，隸屬于鱸形目，杜父魚科，松江鱸魚屬，又名四鰓鱸、花鼓魚、媳婦魚等，主要分布于中國、菲律賓、日本以及朝鮮半島，中國境內(nèi)主要分布于沿海河口地區(qū)，北起鴨綠江，南至福建九江[1]。松江鱸魚味道鮮美，有著“江南第一名魚”之美稱，而且醫(yī)用價值極高，《本草綱目》中有“松江鱸魚，補五臟，益筋骨，和腸胃，益肝腎，治水氣，安胎補中，多食宜人”。但是，近幾十年松江鱸魚野生資源遭到嚴(yán)重破壞，已被列為中國優(yōu)先保護魚類一級動物名錄，國家二級保護動物[1]。目前，如何保護松江鱸魚，盡快恢復(fù)松江鱸魚資源，已成為水產(chǎn)科技人員研究的重要課題。

國內(nèi)外主要開展了對松江鱸人工繁育、胚胎發(fā)育、養(yǎng)殖模式、種群分布和資源狀況、洄游特征、自殘行為等進行了研究，但是對于疾病的研究較少[2-3]。2014 年，松江鱸魚首次在天津繁育成功，養(yǎng)殖期間部分松江鱸開始發(fā)病，主要癥狀為頭頂部嚴(yán)重潰爛、可見頭骨，魚體較正常魚發(fā)白，鰓蓋、鰭條出血等，行動遲緩，停止進食，最后死亡。剖檢可見腹腔內(nèi)有積水，肝臟、脾臟有出血點。從發(fā)病的松江鱸肝臟處分離到一株優(yōu)勢菌，命名為SJL-1，將SJL-1 人工注射到健康松江鱸體內(nèi)，可導(dǎo)致健康松江鱸患病，證實該菌株致病性較強，通過對SJL-1 菌落的基本形態(tài)特征、主要的生理生化特性以及16S rDNA 基因分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，表明該病原菌為鰻弧菌Vibrio anguillarum，最后進一步對SJL-1 進行了藥物敏感性試驗，為防治松江鱸魚潰瘍病提供了參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

發(fā)病松江鱸取自天津某養(yǎng)殖場，體長為8.55±1.36 cm，體質(zhì)量為20.42±1.73 g，發(fā)病時水溫21 ℃。人工感染實驗所用健康松江鱸采自同一養(yǎng)殖場未患病養(yǎng)殖池，規(guī)格大小同患病魚，水溫在21 ℃下暫養(yǎng)7 d 后開始實驗。

1.1.2 主要儀器和試劑

全自動細菌鑒定儀(VITEK 2 compact)購自法國梅里埃公司；普通營養(yǎng)瓊脂購自北京陸橋公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑公司；擴增細菌16S rDNA 所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；細菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，2×PCRmix 購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與培養(yǎng)

病原分離在無菌條件下進行，用75%酒精棉對魚體表消毒，分別從肝臟、腎臟和頭部潰瘍處分離病原，接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，28 ℃條件下倒置培養(yǎng)24～48 h。根據(jù)菌落形態(tài)、大小、邊緣光滑程度等確定優(yōu)勢菌，選取優(yōu)勢菌進一步純化，28 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，得到菌落單一的優(yōu)勢菌。

1.2.2 生化鑒定

對優(yōu)勢菌進行革蘭氏染色，確定優(yōu)勢菌是革蘭氏陽性還是陰性菌，以便選擇不同的菌卡，將培養(yǎng)24 h以內(nèi)的新鮮菌落接到0.85%的生理鹽水，細菌濃度調(diào)到0.5～0.63 個麥?zhǔn)媳葷岫?，在全自動細菌鑒定儀上進行鑒定。

1.2.3 16S rDNA 基因分子鑒定

采用離心柱抽提法提取菌株SJL-1 的基因組，合成細菌16S rDNA 通用引物，正向引物F 序列為：(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)，反向引物R 序列為：(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′)，以提取SJL-1 的DNA 為模板，反應(yīng)體系為50 μL：在0.2 mL 反應(yīng)管中加入2×PCRmix 25μL、濃度為10 nmol·L-1上游引物和下游引物各0.5 μL、22 μL 滅菌水、模板2 μL。PCR 反應(yīng)步驟為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃，30 s、55 ℃，30 s、72 ℃，1 min，進行35 個循環(huán)；72 ℃保溫5 min。PCR 產(chǎn)物送上海生工進行測序，將序列在美國國立生物信息技術(shù)中心網(wǎng)站上進行比對分析，選取部分同源性較高的序列，使用MEGA4.0 軟件N-J 鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 藥物敏感性試驗

藥物敏感性試驗采用K-B 紙片法進行[4]，用血球計數(shù)板將SJL-1 濃度調(diào)至1×108cfu·mL-1，用涂布棒將200 μL 菌液均勻地涂于LB 培養(yǎng)基平板表面，然后將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上，28 ℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，對藥敏片周圍形成的抑菌圈進行測量。依美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)藥敏試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株SJL-1 對18 種藥物的敏感程度。

1.2.5 人工感染試驗

將SJL-1 接種于LB 液體培養(yǎng)基，28 ℃條件下150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，離心后用生理鹽水調(diào)節(jié)菌落濃度到3×108cfu·mL-1。60 尾健康松江鱸隨機分為2 實驗組，感染組和對照組，每組3 個平行，每個平行10 尾魚，采用腹腔注射，劑量為0.1 mL/尾，對照組注射同等劑量的生理鹽水。每天觀察試驗魚的發(fā)病情況并進行死亡統(tǒng)計，連續(xù)觀察14 d，如有發(fā)病魚則按照上述方法重新進行病原分離及鑒定。

2 結(jié)果

2.1 病魚癥狀

發(fā)病松江鱸主要表現(xiàn)為頭部嚴(yán)重潰爛、可見頭骨(圖1)，鰓蓋、鰭條等充血嚴(yán)重(圖2)，身體發(fā)白、腹部膨大、肝臟、脾臟點狀充血，腹腔有積液。

圖1 頭部潰瘍Fig.1 Headulce

圖2 鰓蓋充血Fig.2 Operculum hyperemia

2.2 菌落形態(tài)特征

取病魚肝臟處劃線分離到一株優(yōu)勢菌，命名為SJL-1，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上該菌菌落呈圓形，表面光滑、中央隆起、不透明、淡黃色菌落，直徑約0.8 mm，革蘭氏染色呈陰性。

2.3 生化結(jié)果

采用全自動生化鑒定儀對SJL-1 進行鑒定，選取革蘭氏陰性鑒定卡，鑒定結(jié)果見表1。參照《伯杰氏細菌學(xué)鑒定手冊》以及饒穎竹等[5]對36 株不同來源的鰻弧菌生化反應(yīng)結(jié)果分析，硫化氫、鳥氨酸脫羧酶、側(cè)金盞花醇、N-乙酰-β-半乳糖氨酶、尿素酶、L-阿拉伯醇等指標(biāo)100%為陰性，菌株SJL-1 與以上指標(biāo)完全吻合，結(jié)合菌落形態(tài)初步鑒定該菌株屬于弧菌科的鰻弧菌。

2.4 16S rDNA 分子鑒定結(jié)果

菌株SJL-1 的16S rDNA 基因測序結(jié)果顯示長度為1445bp(圖3)，將其序列在NCBI 進行Blast 比對分析，結(jié)果顯示，菌株SJL-1 與鰻弧菌Vibrio anguillarum(登錄號：X16895)相似度達到99%，采用鄰接法構(gòu)建菌株分子發(fā)育樹(見圖4)，SJL-1 與鰻弧菌聚為一支，結(jié)合其主要生理生化特性，確認鰻弧菌為患肝臟病松江鱸的病原菌。

表1 生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of SJL-1

圖3 菌株SJL-1 16S rRNA 基因序列電泳圖Fig.3 Amplification of 16S rRNAsequence of strain SJL-1

圖4 SJL-1 16S rRNA 基因序列進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain SJL-1 based on 16S rRNA

2.5 藥敏試驗結(jié)果

結(jié)果顯示，在18 種抗菌藥物中，SJL-1 對慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、新生霉素5 種抗生素具有高度敏感性，對左氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、阿莫西林、強力霉素、氨芐西林7 種藥物中度敏感；對青霉素、阿奇霉素、鏈霉素、甲氧嘧啶、奧格門丁、萘啶酸6 種藥物不敏感(表2)。

2.6 人工感染試驗結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，注射組在第5 d 開始個別魚患病并出現(xiàn)鰓蓋充血等典型癥狀，14 d 內(nèi)死亡率高達70%，對照組沒有死亡病例。從具有典型癥狀的患病松江鱸體內(nèi)重新分離到了鰻弧菌，證實鰻弧菌是引起這次松江鱸潰瘍病的主要病原菌。

表2 SJL-1 藥物敏感試驗Tab.2 Drug sensitivity test of SJL-1

3 討論

目前，有關(guān)松江鱸疾病研究報道較少，主要是水霉病、白皮病、細菌性爛鰓、車輪蟲病等。張飛明等[6]報道松江鱸白皮病的主要癥狀是魚體頭頂部和背部表皮受傷明顯，嚴(yán)重時露出骨骼；他分析病因為魚頭部、背部受創(chuàng)傷后，細菌感染所致，但沒有進行病原菌的分離鑒定等研究。潘連德[7]報道松江鱸白皮病主要原因是臨產(chǎn)和產(chǎn)后的親魚被魚巢刮傷皮膚，進而感染細菌,臨床癥狀為頭部及體表發(fā)炎、腫脹、嚴(yán)重的表現(xiàn)潰瘍,患病魚體表發(fā)白。隨著病情逐漸惡化,病魚出現(xiàn)單獨游動,反應(yīng)較健康魚遲鈍，停止攝食，作者分析病因為魚體創(chuàng)傷后感染一種氣單胞菌。

鰻弧菌引起的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病在世界范圍內(nèi)流行，可感染斜帶石斑魚Epinephelus coioides[5]、丁鱥Tinca tinca[8]、香魚Plecoglossus altivelis[9]、鱸魚Lateolabrax japonicus[10]、鱈魚Gadus morhua[11]、大菱鲆Scophthalmus maximus[12-13]、牙鲆Paralichthys olivaceus[14]、大黃魚Larimichthys crocea[15]等。鰻弧菌是一種條件致病菌，在一些養(yǎng)殖條件不利的情況下便會誘發(fā)魚類患病，如養(yǎng)殖水體水質(zhì)不良、魚體受到刺激或者受傷等。鰻弧菌有多種感染途徑，通過皮膚、鰓以及腸道組織侵入等。感染鰻弧菌的魚會出現(xiàn)全身性的組織病變。不同的魚感染鰻弧菌后會表現(xiàn)不同的癥狀，但主要癥狀是體表、鰓蓋出血，鰭部、肝臟、有黃色粘稠腹水等。感染鰻弧菌的養(yǎng)殖牙鲆最明顯的癥狀是鰭條、鰭基部以及鰓骨充血發(fā)紅,肛門紅腫，肌肉組織點狀出血，體表發(fā)黑,鰭部潰爛[14]。感染了鰻弧菌的大菱鲆，主要癥狀為鰓蓋、體表有出血點，腹腔膨脹有積液，脾臟、肝臟出血，腸道內(nèi)有淡黃色黏液[15]。本文中發(fā)病松江鱸的癥狀與牙鲆、大菱鲆感染鰻弧菌后相似。

郭楊柳等[12]報道從患病大菱鲆分離到的鰻弧菌對氟苯尼考、頭孢唑啉、慶大霉素等藥物高敏；饒穎竹等[5]從患病斜帶石斑魚分離到的鰻弧菌對慶大霉素、新生霉素、阿奇霉素、氟苯尼考、利福平、諾氟沙星和左氟沙星等7 種抗菌藥物高度敏感；張昕等[16]用8 種常用抗生素對4 種常見致病性弧菌進行藥物敏感性試驗，其中鰻弧菌對慶大霉素、氯霉素具有敏感性。本試驗挑選了18 種抗菌藥物，對SJL-1 進行藥物敏感性試驗，鰻弧菌對慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、新生霉素5 種抗生素具有高度敏感性，綜合以上研究結(jié)果，鰻弧菌主要對慶大霉素、新生霉素、氟苯尼考等藥物敏感，為治療松江鱸鰻弧菌病提供用藥指導(dǎo)。