兩種血袋白膜法制備濃縮血小板質量研究

余鳳秀, 周載鑫, 沈 秋, 朱燕霞, 錢寶華

(上海長海醫(yī)院 輸血科, 上海, 200433)

血小板是血液的重要成分之一。單采血小板具有耗時長、成本昂貴、創(chuàng)傷較大等缺點，限制了臨床血小板的應用[1]。從抗凝全血中制備濃縮血小板可高效利用血液資源，緩解臨床血小板緊張狀況[2]。傳統(tǒng)四聯(lián)袋分離過程中血漿、白膜層均通過同一管道被擠出血袋，但白膜層在分離過程中易吸附于血袋壁，且分離過程中血小板層與紅細胞層易混合，影響回收率與血小板質量。頂?shù)状诜蛛x過程中首先分出上層血漿，再向下分離出濃縮紅細胞，將白膜層完全保留在血袋中，有效保留了血小板層[3]。本研究探討頂?shù)状c四聯(lián)袋對白膜法制備濃縮血小板質量的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

實驗組多聯(lián)袋為一次性使用塑料血袋(頂?shù)状?，?guī)格Q200-T, 批號171116 11A, 上海輸血技術有限公司); 對照組多聯(lián)袋為一次性使用塑料血袋(傳統(tǒng)型，規(guī)格Q200, 批號170828 22A, 上海輸血技術有限公司)。一次性使用塑料血袋(四聯(lián)袋，規(guī)格Q400, 批號171226 21A, 上海輸血技術有限公司)。

相關設備包括無菌接管機(Terumo 日本)、離心機(Cryofuge6000i 賀利氏，德國)、CompoMatG5全自動血細胞分離機(費森尤斯卡比，德國)、血細胞分析儀(Sysmex XS-500i, 日本)、電子天平(精度0.1 g, 普瑞遜PRIS HF-1500S)、分漿夾(蘇州醫(yī)用儀器廠)。

1.2 方法

① 選擇符合健康體檢規(guī)范、獻血前各項檢驗合格、年齡20～30歲的獻血者; ② 采血過程順暢，采血時間≤7 min，采集全血400 mL; ③采集全血室溫靜置1 h, 充分混合均勻，使用無菌接管機均分至頂?shù)状退穆?lián)袋(傳統(tǒng)型)中，每袋含200 mL全血; ④ 采用CompoMatG5全自動血細胞分離機進行第1次離心(離心力2 096×g, 2 500轉/min, 14 min, 22 ℃), 離心后血液分為3層，上層為血漿，中間層為白膜層，下層為濃縮紅細胞; ⑤ 采用CompoMatG5全自動血細胞分離機進行第2次離心(離心力 299×g, 900轉/min, 10 min, 22 ℃)。

頂?shù)状苽錆饪s血小板: 采集全血400 mL, 應用無菌接管機均分200 mL全血至頂?shù)状?，進行第1次離心(離心力 2 096×g, 2 500轉/min, 14 min, 22 ℃), 制備白膜層。實驗組將頂?shù)状?00 mL全血置于G5全自動血液成分分離機相應位置，采用電動擠壓方式，利用精密探頭、熱合探測閥門、白膜層制備濃縮血小板程序(全程操作均為電腦設置程序，按照制備要求控制時間和量以及開關止流夾等)。折斷聯(lián)袋連接各管道折芯，擠壓板分別向上擠壓出上層血漿，在距離白膜層1.5 cm處停止擠壓，再向下擠壓出濃縮紅細胞，距離白膜層1.0 cm處停止擠壓，關閉紅細胞懸液袋上端，擠出約120 mL濃縮紅細胞并與紅細胞保存袋中保存液混合制備成紅細胞懸液。中間富含血小板的白膜層完全留在頂?shù)状校覝叵蚂o置2 h, 使血小板與白細胞自然解聚。再經(jīng)過第2次離心(離心力299×g, 900轉/min, 10 min, 22 ℃), 采用手工擠壓板分離上層富含血小板血漿約30 mL, 去除殘留紅細胞、白細胞。

四聯(lián)袋制備濃縮血小板: 采集全血400 mL, 應用無菌接管機均分200 mL全血至四聯(lián)袋(傳統(tǒng)型)進行第1次離心(離心力 2 096×g, 2 500轉/min, 時間14分鐘, 22 ℃), 制備白膜層。對照組: 四聯(lián)袋中200 mL全血置于G5全自動血液成分分離機相應位置，采用電動擠壓方式，利用精密探頭、熱合探測閥門、白膜法制備濃縮血小板程序(全程操作均為電腦設置程序按照制備要求控制時間和量以及開關止流夾等)。折斷聯(lián)袋連接各管道折芯，擠壓板向上擠壓出上層血漿，在距離白膜層1.5 cm處停止擠壓，關閉血漿袋上端，將距離白膜1.5 cm處血漿連同白膜層一起擠壓到白膜層袋中。將紅細胞保存袋中添加劑擠壓到主袋(紅細胞懸液中)。熱合并取下白膜層袋，室溫下靜置2 h, 使血小板與白細胞自然解聚。經(jīng)過第2次輕離心(離心力299×g, 900轉/min, 10 min, 溫度22 ℃), 采用手工擠壓板分離上層富含血小板血漿約30 mL, 去除殘留紅細胞、白細胞等。

1.3 統(tǒng)計學分析

血液中各成分含量采用血細胞計數(shù)儀(Sysmex XS-500i)分析; 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料采用方差分析，計量資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 血小板總量及回收率

頂?shù)状鼘嶒灲M血小板計數(shù)為(986.0±277.0)×109/L, 濃縮血小板體積為(46.5±11.5)mL, 血小板回收率為91.0%; 四聯(lián)袋對照組血小板計數(shù)為(705.0±322.0)×109/L, 濃縮血小板體積為(49.8±8.4)mL, 血小板回收率為69.0%, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 頂?shù)状c四聯(lián)袋血小板質量比較

2.2 懸浮紅細胞質量分析

頂?shù)状鼘嶒灲M紅細胞體積為(163.0±12.0)mL, 紅細胞回收率為81.0%; 四聯(lián)袋對照組紅細胞體積為(179.0±10.0)mL, 紅細胞回收率為90.0%, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。頂?shù)状鼘嶒灲M與四聯(lián)袋對照組紅細胞計數(shù)分別為(5.2±0.5)×109/L與(5.4±0.5)×109/L, 血紅蛋白含量分別為(154.0±15.0)×109g/L與(159.0±13.0)×109g/L, 差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。頂?shù)状鼘嶒灲M與四聯(lián)袋對照組紅細胞懸液中白細胞殘留分別為(2.8±1.5)×106/L與(4.4±1.9)×106/L, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。頂?shù)状虮Ａ糁虚g白膜層，有少許紅細胞殘留，導致最終紅細胞懸液體積略有差異，頂?shù)状t細胞回收率略低于傳統(tǒng)四聯(lián)袋。見表2。

表2 紅細胞懸液質量比較

2.3 血漿質量分析

頂?shù)状鼘嶒灲M血漿含量為(108.7±14.4)mL, 四聯(lián)袋對照組血漿含量為(109.2±16.5)mL, 差異無統(tǒng)計學意義(P=0.899)。2組血漿中殘留紅細胞、血小板、白細胞及血紅蛋白含量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。頂?shù)状c四聯(lián)袋在制備血漿的工藝上并無差別，質量也較為穩(wěn)定。見表3。

表3 2組血漿質量分析

3 討 論

抗凝全血中含有大量的血小板，在未進行手工制備濃縮血小板的情況下，這些血小板在紅細胞懸液保存的過程中快速失效，并未能發(fā)揮作用，造成極大浪費; 失效后的血小板亦作為某種多余的組分存在于紅細胞懸液中，存在引發(fā)輸血不良反應的風險[4-5]。雖然機采血小板因其采集制備自動化標準化而在中國、美國等國家得到廣泛的應用[6]，但歐洲各國手工血小板制備方式靈活多樣、血液來源豐富、成本低廉，仍然占據(jù)主流地位。

目前臨床機采血小板主要應用于治療體內血小板減少。手工法制備血小板由于濾白技術的發(fā)展，減少了匯集濃縮血小板輸注的不良反應，在治療血小板減少應用方面得到了提升。此外，濃縮血小板在體外的應用也是近年研究的熱點之一[3]。KAZAKOS K[7]將PRP應用于創(chuàng)面修復取得了良好的效果，相較于未使用組，患者創(chuàng)面愈合和預后明顯改善。濃縮血小板應用軟組織及骨組織的修復則更為多見，一項國外大型研究[8]表明，濃縮血小板可以有效促進損傷的修復，而濃縮血小板的體外應用在國內的研究還較為少見。

限制濃縮血小板應用的一個關鍵問題是目前國際、國內缺乏統(tǒng)一的濃縮血小板的制備標準及嚴格的質量標準，現(xiàn)有的血小板質量評價標準主要以CCI等來確定血小板輸注的療效。然而，這些指標對于在血小板制備過程中的指導作用不強，無法合理迅速地制備后輸注前的質量標準。國內這方面體現(xiàn)的研究正在進行[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，一方面血小板在靜置時會出現(xiàn)一定的物理性可逆的聚集和黏附現(xiàn)象，在靜置、離心以及轉移的過程中，會有一定量的血小板因為聚集和黏附的作用，成團聚集吸附在血袋壁及導管等處，應用頂?shù)状蛛x血小板時，由于白膜層被保留在原始袋中，待血小板與白細胞自然解聚后再行分離富含血小板血漿，制備濃縮血小板，可以有效減少血小板因聚集吸附特性導致的損失，提高血小板制備的質量; 另一方面，頂?shù)状蛛x時，因為從上聯(lián)導管分離血漿，從下聯(lián)導管分離紅細胞，分離過程中白膜層黏附于血袋壁并不會減少白膜層的回收率，因此可以不考慮白膜層的回收率而充分分離紅細胞，減少紅細胞過分損失，因而懸浮紅細胞的質量有了明顯的提升。而在手工分離時，為了充分分離白膜層，會有部分紅細胞分離進入白膜層，從而造成紅細胞損失較大。

綜上所述，頂?shù)状诜蛛x濃縮血小板方面相較于傳統(tǒng)四聯(lián)袋有一定的優(yōu)勢，在一些手工濃縮血小板應用較多的歐洲國家也得到廣泛的應用。在中國，單采血小板應用較多，傳統(tǒng)手工濃縮血小板也不能忽視，頂?shù)状梢栽诟谎“逖獫{的研究和應用中發(fā)揮更多的作用。