口腔鱗狀細胞癌患者組織、血清及血清外泌體中脂多糖結(jié)合蛋白的表達水平及意義

董建偉, 朱含九, 李阿峰

(1.陜西省商洛市中心醫(yī)院 口腔科, 陜西 商洛, 726000;2.陜西省商南縣中醫(yī)院 口腔科, 陜西 商洛, 726300)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是一種發(fā)生于口腔頜面部的惡性腫瘤，男性患者多于女性[1]。脂多糖也被稱之為內(nèi)毒素，是組成革蘭陰性菌外膜的主要成分[2]。脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)是脂多糖在急性期與蛋白脂多糖結(jié)合成形的蛋白成分，能夠?qū)е聶C體免疫防御屏障功能下降，引發(fā)全身炎癥性反應(yīng)或急性肺損傷以及膿毒性休克等疾病[3-4]。LBP能夠促使單核巨噬細胞產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，增加幽門螺桿菌數(shù)量，進而增高胃癌風險。因此LBP水平與惡性瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。本研究探討OSCC患者血清、組織、血清外泌體中LBP的表達及意義，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2016年10月—2019年10月確診為OSCC的60例患者設(shè)為觀察組，選取同期60例健康體檢者作為對照組。觀察組男40例，女20例; 年齡60～75歲，平均(66.36±1.20)歲; 對照組男36例，女24例; 年齡56～74歲，平均(65.89±1.59)歲。2組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

組織檢測: 采集所有觀察組患者的癌組織(需要避開糜爛區(qū)域癌組織)以及癌旁組織(距腫瘤邊界2 cm以上位置取標本)[9], 置于RNA Keeper Tissue Stabilizer的空管以及EP管中，放置于-80 ℃保存。采用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)試劑進行檢測，試劑盒為配套產(chǎn)品，嚴格按照操作說明書進行。

樣本RNA提取以及cDNA的合成: 取出RNA保護液中的癌旁組織以及癌組織，剪碎處理、進行勻漿，提取總RNA, 再使用配套試劑盒進行cDNA的轉(zhuǎn)錄，然后進行熒光定量試驗。反應(yīng)總體系為20 μL, 反應(yīng)程序為預(yù)變性: 95 ℃, 30 s。PCR: 95 ℃, 5 s; 60 ℃, 30 s; 40個循環(huán)。熔解: 95 ℃, 15 s; 95 ℃, 1 min; 95 ℃, 15 s。

血清采集: 采集所有研究者肘靜脈血5 mL, 離心15 min后取上清液，在-80 ℃的環(huán)境中保存。外泌體制作: 取250 μL血清，加入63 μL Exo-Quick ExosomePrecipitation solution, 進行分泌體裂解，保存于-80 ℃的環(huán)境中。選取BCA試劑盒測定樣品外泌體蛋白質(zhì)濃度，在其中加入5XSDS緩沖液，變性95 ℃, 10 min, 保存于-80 ℃的環(huán)境中。

血清及外泌體蛋白水平測定: 采用蛋白免疫印跡法，將LBP抗體置96孔板，包被處理，加入待測樣品以及標準品，并加入生物素化的LBP抗體，之后充分洗滌，加入抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，發(fā)生HPR催化TMB產(chǎn)生藍色產(chǎn)物后終止反應(yīng)，在15 min內(nèi)空白調(diào)零，通過酶標儀測量450 mm 波長下吸光度，即為OD值。

1.3 觀察指標

① 比較OSCC患者癌組織、癌旁組織中LBP mRNA表達水平，分析OSCC患者癌組織中LBP mRNA的表達水平與臨床特征的關(guān)系; ② 統(tǒng)計并分析健康體檢者與OSCC患者血清外泌體以及血清LBP表達水平; ③ 統(tǒng)計并分析OSCC患者血清LBP表達量與臨床特征的關(guān)系; ④ 統(tǒng)計并分析OSCC患者血清外泌體LBP表達量與臨床特征的關(guān)系[10]。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 OSCC患者癌組織LBP mRNA的表達水平與臨床特征關(guān)系分析

OSCC患者癌組織中LBP mRNA表達量為(0.81±0.23), 癌旁組織表達量為(0.91±0.44), 差異無統(tǒng)計學意義(t=1.560,P=0.061)。吸煙、飲酒患者中LBP mRNA表達量在癌組織中較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 OSCC患者癌組織中LBP mRNA表達水平與臨床特征關(guān)系分析

2.2 健康體檢者與OSCC患者血清外泌體表達水平以及血清LBP表達分析

2組血清外泌體LBP表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 2組血清LBP表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清外泌體以及血清中LBP

2.3 OSCC患者血清外泌體LBP mRNA表達量與臨床特征關(guān)系分析

淋巴轉(zhuǎn)移、飲酒OSCC患者血清外泌體LBP mRNA表達量高于無淋巴轉(zhuǎn)移及不飲酒患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表3。

表3 OSCC患者血清外泌體LBP mRNA表達量與臨床特征關(guān)系分析

2.4 OSCC患者血清LBP mRNA表達量與臨床特征關(guān)系分析

OSCC患者血清LBP mRNA表達量與TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、分化程度、吸煙、飲酒等臨床特征無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

研究[11-14]顯示，特異性腫瘤標志物最易在人體血清中發(fā)現(xiàn)，因此應(yīng)該對惡性腫瘤患者進行血清以及血清外泌體指標監(jiān)測。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌組織與癌旁組織中的LBP mRNA表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 吸煙、飲酒OSCC患者LBP mRNA含量高于無抽煙、飲酒習慣的患者，說明飲酒、抽煙是OSCC發(fā)展的促進因子[15-17]。

本研究對OSCC患者與健康體檢者血清以及血清外泌體蛋白質(zhì)進行了分析，結(jié)果表明, 2組血清外泌體LBP表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 提示OSCC患者血清外泌體中LBP含量與健康人群比較無顯著差異，但OSCC患者伴有淋巴轉(zhuǎn)移或者有飲酒習慣時，則LBP含量明顯升高。可見，外泌體中的LBP含量是OSCC的驅(qū)動因子。此外，2組血清LBP表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

綜上所述，LBP是一種Ⅰ型急性期反應(yīng)蛋白，存在于人體血清中，當人體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，其濃度明顯增高[18-19]。本研究結(jié)果證實，LBP可以作為OSCC轉(zhuǎn)移的標志物，也可以作為靶向治療的突破口。因此，檢測OSCC患者血清中的LBP水平對于早期診斷和治療具有重要意義。此外，改善患者抽煙、飲酒不良習慣，能夠促進身體恢復(fù)。