食管鱗狀細胞癌piRNA-19166的表達及其臨床病理意義

郭玉蓮, 顏 云, 王成海, 3

(1.揚州大學醫(yī)學院/轉化醫(yī)學研究院 病理學教研室, 江蘇 揚州, 225009;2.江蘇省寶應縣人民醫(yī)院 病理科, 江蘇 寶應, 225800;3.江蘇省中西醫(yī)結合老年病防治重點實驗室, 江蘇 揚州, 225009)

食管癌是消化系統常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居所有疾病的第9位以及癌癥相關死亡疾病的第6位[1]。食管癌的病理組織學類型主要包括食管鱗狀細胞癌和食管腺癌，而食管鱗狀細胞癌是亞洲地區(qū)常見的病理類型[2]。在中國，食管鱗狀細胞癌占所有食管癌的90%, 其主要發(fā)病部位為食管的中下段[3-4]。食管癌致病的危險因素有飲食習慣、環(huán)境因素和遺傳因素等[5]。近年來，與PIWI蛋白相互作用的核糖核酸(piRNAs)逐漸成為腫瘤研究的熱點之一, piRNAs是在生殖細胞和體細胞中發(fā)現的一類非編碼RNA[6], 包含24～31個核苷酸, piRNAs與PIWI蛋白結合形成piRNA/PIWI復合物，對精子形成、表觀遺傳調節(jié)和生殖干細胞維持等均有影響[7]。研究[8-9]表明piRNAs與包括惡性腫瘤在內的多種疾病有關。多項研究[10-11]證實, piRNAs異常表達已經成為腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的關鍵因素。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)技術檢測piRNA-19166在食管鱗狀細胞癌及相應癌旁正常組織中的表達水平，分析piRNA-19166表達水平與食管鱗狀細胞癌病理參數的相關性及臨床病理意義，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取2018年10月—2020年3月揚州大學附屬醫(yī)院96例外科手術患者的新鮮食管鱗狀細胞癌組織和相應正常食管組織標本，年齡39～74 歲，中位年齡62.0歲; 男50例，女46例。所有患者術前未經過放療和化療處理。食管鱗狀細胞癌由病理科醫(yī)師明確診斷。標本使用及臨床資料的收集均經揚州大學醫(yī)學院倫理委員會批準，并與患者簽署知情同意書。采集新鮮食管鱗狀細胞癌組織后立即放入液氮罐里,-80 ℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 qRT-PCR

提取食管癌腫瘤組織總RNA, 將RNA逆轉錄成互補DNA(cDNA), 使用 Takara 生物公司qRT-PCR反應試劑盒，反應體系為25.0 μL, cDNA為1.0 μL, 12×SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ 2.5 μL, 上、下游引物各1.0 μL, 加無核酸酶水調整體系至25.0 μL, 每組樣本有3個復孔，內參為U6。最后在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system儀器上讀取定量PCR反應Ct值，結果以2-ΔΔCt計算。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 食管鱗狀細胞癌組織piRNA-19166的表達

96例食管鱗狀細胞癌組織中, 71例piRNA-19166表達下降, 25例表達正?；蛏? 與癌旁正常食管組織相比，食管鱗狀細胞癌中piRNA-19166呈低表達，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

與食管癌組織比較, **P<0.01

2.2 食管癌細胞株中piRNA19166的表達

應用實時熒光定量實驗方法檢測3種食管癌細胞系(EC9706, TE-1, ECa10)及正常食管上皮細胞(HEE-1)中piRNA-19166的表達情況，結果顯示，與正常食管上皮細胞相比, piRNA-19166在食管癌細胞株EC9706、TE-1、ECa10中均呈低表達，其中ECa10細胞、EC9706細胞中piRNA-19166低表達差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

與HEE-1比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.3 食管鱗狀細胞癌組織中piRNA19166的異常表達及其與臨床病理的關系

本研究分析piRNA-19166在RNA水平上的相對表達量與患者年齡、性別、吸煙情況、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期的關系。根據食管鱗狀細胞癌組織中piRNA-19166的表達水平分為低表達組和正常/高表達組。結果顯示, piRNA-19166低表達與分化程度(P=0.001)、淋巴結轉移(P=0.001)、TNM分期(P=0.006)有顯著相關性。見表1。

表1 食管鱗狀細胞癌組織中piRNA19166的表達及其與臨床病理的關系

3 討 論

食管癌是一類來源于食管鱗狀上皮和腺上皮的癌癥，其發(fā)病率位居消化系統腫瘤的第3位[12-15]。在中國，絕大多數食管癌的病理類型為鱗狀細胞癌，因此研究食管鱗狀細胞癌的病因、發(fā)病機制、診斷指標和治療靶點尤為重要。作為一類小的非編碼蛋白RNA, piRNA與PIWI蛋白結合而發(fā)揮其生物學活性作用[16-18]。大多數piRNAs在人類發(fā)生腫瘤時會出現表達異常，只有少數piRNAs在腫瘤和正常組織中表達一致[19-20]。目前, piRNA對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響已經成為腫瘤研究的新熱點，許多piRNAs在腫瘤組織中表達失調，發(fā)揮促進或抑制的作用。微小RNA也是一類小的非編碼蛋白RNA, 通常與靶基因的3′非翻譯區(qū)互補結合，抑制其蛋白質翻譯，而piRNAs一般不與靶基因的DNA互補，這表明piRNAs通過其他生物學方式發(fā)揮表觀遺傳調節(jié)作用[21-22]。

目前多認為piRNAs的異常表達是一種癌癥潛在的病理性特征, LI BB等[23]研究表明，由多發(fā)性骨髓瘤細胞外囊泡攜帶的piRNA-823能改變內皮細胞的生物學特性，這一點對于多發(fā)性骨髓瘤細胞能適合生長的獨特環(huán)境至關重要，也為piRNAs治療多發(fā)性骨髓瘤的預后評估提供了前期研究基礎。在大腸癌患者組織和血清中, piRNA-54265表達水平升高，并與患者預后較差密切相關。功能性試驗[24]證明, piRNA-54265結合PIWIL2 蛋白通過PIWIL2/STAT3/p-SRC復合體激活STAT3信號通路，促進大腸癌細胞的增殖、轉移以及抗藥性。LIN X等[25]運用piRNAs芯片技術在胃癌組織中鑒定出50種與癌癥相關的piRNAs, 得出piRNAs在致病因子中扮演重要的角色。在乳腺癌組織中, piRNA-36712的表達水平顯著低于正常乳腺組織，低水平的piRNA-36712與患者的臨床預后不良相關, piRNA-36712的下調引起硒蛋白W1(SEPW1)過度表達，從而促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移。研究[26]還發(fā)現, piRNA-36712與紫杉醇和阿霉素這2種乳腺癌化療藥物具有協同抗癌作用。

本研究采用qRT-PCR技術檢測出食管鱗狀細胞癌組織中piRNA-19166表達水平下降的比率約為74.0%, 而在少數患者中piRNA-19166是正常表達或高表達; 同時, piRNA-19166在食管癌細胞株中的表達水平也低于正常的食管上皮細胞株。上述結果提示, piRNA-19166可能是一種新的食管癌腫瘤抑制基因，其失活或受到抑制后影響了食管癌的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究還分析了piRNA-19166在食管鱗狀細胞癌組織中的表達水平與患者臨床病理參數的相關性，證實低表達的piRNA-19166與食管鱗狀細胞癌的分化程度、淋巴結轉移和TNM分期密切相關，即piRNA-19166表達水平越低，食管癌的分化程度越低，癌細胞惡性程度越高，癌細胞越容易從附近的淋巴結轉移，以及TNM分期越晚，患者預后也就越差。

綜上所述, piRNA-19166可能是一種新的食管癌腫瘤抑制基因，低表達的piRNA-19166促進了食管癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移。