生物樣品前處理技術(shù)在脂質(zhì)分析中的應(yīng)用

賈 波，吳津津，張?jiān)旗o,3

（1.襄陽市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北襄陽441000；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230012；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230012）

脂質(zhì)是一類完全或者部分由硫酯的碳負(fù)離子縮合或由異戊二烯的碳正離子縮合產(chǎn)生的疏水或兩親性的小分子[1]。根據(jù)脂質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)差異，脂質(zhì)主要分為脂肪酰類（fatty acyls）、甘油脂類（glycerolipids）、甘油磷脂類（glycerol-phospholipids）、鞘脂類(sphingolipids)、固醇脂類（smrol|ipids）、異戊烯醇類（prenol lipids）、糖脂類（saccharolipids）、聚酮體類（polyketides）八大類別。每一類型的脂質(zhì)又由于極性頭基、碳鏈長度或不飽和度的差異形成不同的結(jié)構(gòu)，由此組成種類繁多、性質(zhì)各異的脂質(zhì)分子。作為生物系統(tǒng)中一類重要的小分子，脂質(zhì)在許多生物過程中起著多種重要作用[2-3]。脂質(zhì)是形成細(xì)胞膜和亞細(xì)胞膜的基質(zhì)，保證了細(xì)胞膜的完整性。此外，脂質(zhì)還參與了細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞[4]，脂質(zhì)合成和代謝的異常會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、高血脂癥、老年癡呆癥和癌癥[5-8]等疾病。

脂質(zhì)組學(xué)是對(duì)整體脂質(zhì)進(jìn)行分析的學(xué)科，對(duì)脂質(zhì)組學(xué)的深入研究在探索生命活動(dòng)和疾病機(jī)理、疾病的預(yù)防控制及診斷、揭示藥物對(duì)生物體的作用機(jī)制、藥物研發(fā)、環(huán)境學(xué)、營養(yǎng)與健康以及食品科學(xué)等方面有著重要的意義[9]。脂質(zhì)組學(xué)主要對(duì)生物樣本代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量研究，分析對(duì)象多為生物樣本，大多數(shù)生物來源中樣本均可提取脂質(zhì)進(jìn)行分析，包括血漿、血清、全血、干血斑、腦脊液、組織、尿液、細(xì)胞、糞便、植物、微生物等。準(zhǔn)確、靈敏、可靠的脂質(zhì)分析方法至關(guān)重要。質(zhì)譜法已經(jīng)成為研究脂質(zhì)最有利的工具之一[10]，目前常采用質(zhì)譜-色譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行分離和研究，包括氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）、超臨界流體色譜-質(zhì)譜法（SFC-MS）等，其中以GC-MS研究歷史最長并涵蓋了豐富的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。由于生物樣品成分復(fù)雜，分析之前需要對(duì)樣本進(jìn)行前處理。GC-MS所需的高溫條件容易破壞不穩(wěn)定的脂質(zhì)組份，因此揮發(fā)性脂質(zhì)需提前進(jìn)行衍生化處理。

脂質(zhì)分析的第一步是在提取脂質(zhì)前正確地采集和儲(chǔ)存生物樣品。樣品采集后應(yīng)盡快進(jìn)行脂質(zhì)提取，以限制脂質(zhì)的降解，否則應(yīng)立刻進(jìn)行冷凍保存。第二步是從生物樣品中提取脂質(zhì)[11-12]。本文對(duì)脂質(zhì)組學(xué)分析中生物樣本前處理研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 基于液相的萃取方法

1.1 液液萃取

液液萃?。↙LE）是脂質(zhì)組學(xué)研究中最常用的生物樣本前處理制備方法，利用目標(biāo)組分在互不相溶溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離，分離效率高。由于脂質(zhì)不溶于水，常用有機(jī)溶劑作為提取溶劑，細(xì)胞組織、血漿、血清等生物樣本都可以利用液液萃取進(jìn)行前處理，其中最常用的三種方法是Folch法、Bligh-Dyer法和Matyash法[13]。其中Folch法是最廣泛的使用方法，利用氯仿∶甲醇∶水（8∶4∶3，V/V/V）混合溶劑進(jìn)行全脂提取，脂質(zhì)在氯仿中濃縮。Bligh-Dyer法是對(duì)Folch法的改進(jìn)，利用相同的溶劑體系，但不同體積比的氯仿∶甲醇∶水（2∶2∶1.8），以此減少有機(jī)溶劑用量，與Folch法相比，提高了提取效率，獲得了較高的脂質(zhì)回收率。

上述兩種提取方法在進(jìn)行脂質(zhì)提取時(shí)，由于含有脂質(zhì)的有機(jī)相位于兩相溶液的下層，都容易損失樣品并且可能造成溶液污染，且氯仿具有致癌性。Matyash等[14]使用低密度甲基叔丁酰乙醚（MTBE）∶甲醇∶水（10∶3∶2.5，V/V/V）提取生物樣品中的脂質(zhì)組份，使用MTBE代替氯仿，降低了溶劑的毒性。Matyash法與上述兩種方法提取效率相當(dāng)。

基于液液萃取方法的脂質(zhì)組學(xué)萃取體系在以上三種方法上不斷改進(jìn)，在多個(gè)領(lǐng)域展開應(yīng)用，不同方法的效果比較擁有大量的文獻(xiàn)資料。Ulmer等[15]研究了這三種方法對(duì)人血漿脂質(zhì)組學(xué)的提取效率，發(fā)現(xiàn)Folch或Bligh-Dyer方法的血漿樣品與總?cè)軇┍葹?∶20（V/V）時(shí)提取效率最高。Vale G等[16]提出了一種不同于上述萃取方法的三相液體萃?。?PLE）方法，3PLE包括使用兩個(gè)有機(jī)相和一個(gè)水相，以來源不同的生物樣品，如牛肝、人血漿和小鼠肝來進(jìn)行脂質(zhì)提取，成功地獲得了78種脂質(zhì)。

1.2 單一有機(jī)溶劑萃取

單一有機(jī)溶劑萃?。⊿ingle Organic Solvent Extraction，SOSE）是一種只使用一種有機(jī)溶劑的樣品制備方法，因此比兩相和三相混合萃取更簡單和方便，甲醇是SOSE中最常用的有機(jī)溶劑，能從不同基質(zhì)中提取出極性代謝物。異丙醇是SOSE中第二種最常用的脂質(zhì)分析溶劑。Christinat等[17]利用異丙醇單一有機(jī)溶劑提取96個(gè)人血漿樣品中的非酯化脂肪酸。Merrill等[18]通過單相異丙醇對(duì)神經(jīng)元樣品提取，經(jīng)過比對(duì)，針對(duì)該實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)元提取，SOSE方法的回收率和nLC/MS峰形最優(yōu)。聯(lián)合一種優(yōu)化的LC-MS檢測(cè)從哺乳動(dòng)物活腦中鑒定的神經(jīng)元中（采用膜片鉗技術(shù)從灌流小鼠腦片中捕獲神經(jīng)元細(xì)胞體，并采用優(yōu)化的納米LC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)其脂質(zhì)進(jìn)行分析）獲得40多種脂質(zhì)。但是，SOSE在生物樣本脂質(zhì)前處理中應(yīng)用有局限，由于其分離能力很差，即便操作簡單，尚未廣泛應(yīng)用于生物樣本的脂質(zhì)前處理中。

2 基于固相的萃取方法

固相萃?。⊿olid-Phase Extraction，SPE）是從上世紀(jì)80年代中期開始發(fā)展起來的一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)，主要通過固相填料對(duì)樣品組分的分配系數(shù)不同實(shí)現(xiàn)樣品分離。根據(jù)材料的類型，商用SPE柱分為反相柱、正相柱和離子交換柱，在脂質(zhì)分析中使用適當(dāng)?shù)腟PE柱有助于抑制基質(zhì)干擾，從而改善基質(zhì)干擾、低豐度成分的檢測(cè)靈敏度和回收率，以及擴(kuò)大脂質(zhì)種類的檢測(cè)覆蓋率。目前最常用的固相柱為C8和C18柱。SPE對(duì)脂質(zhì)的選擇性很高，因此是靶向脂質(zhì)分析的首選方法。在SPE基礎(chǔ)上發(fā)展起來的固相微萃?。⊿olid-Phase Micro-Extraction，SPME）同樣得到了廣泛應(yīng)用。

SPME是一種由Arthur和Pawliszyn于1990年提出的樣品制備方法，常使用一根帶有涂層的纖維用于萃取分析物，基于靜電作用、離子交換作用、疏水相互作用等作用力實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中脂質(zhì)的分離、純化和富集[19]，目前使用較多的涂層有聚丙烯腈（PAN）、聚二甲基硅氧烷（PDMS）和聚苯胺（PANI）等。SPME有效地降低了基質(zhì)效應(yīng)，這種方法通常與LC或LC-MS結(jié)合使用，對(duì)液體和固體樣品等各種生物樣品的分析具有良好實(shí)用性，分析效率高，易于自動(dòng)化[20]。SPME局限性主要在于提取能力小，因此，主要適用于少量樣本的前處理。

分散微固相萃取（dispersive Microsolid Phase Extraction，dMSPE）是近年來發(fā)展起來的一種改進(jìn)型分散固相萃取技術(shù)。萃取過程包括：①將待測(cè)物捕集到直接分散在樣品中的吸附劑中；②離心或過濾分離吸附劑；③用適當(dāng)?shù)慕馕軇┫疵?解吸分析物。與傳統(tǒng)的SPE相比，dMSPE的主要優(yōu)點(diǎn)是溶劑消耗少、操作簡便、時(shí)間短、凈化效率高、吸附劑可以混合。Bakhytkyzy等[21]建立了人乳脂質(zhì)組學(xué)的分散微萃取方法，采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE）方法研究了提取工藝條件對(duì)脂質(zhì)體覆蓋率和重復(fù)性的影響，考查了脫附溶劑、固定相比、吸附時(shí)間等因素對(duì)萃取效果的影響。結(jié)果表明，以27 mg的C18與3 mg的氧化鋯涂層硅膠混合作為吸附劑，甲醇∶2-丙醇∶氨水（14∶81∶5，V/V/V）混合物為解吸劑，提取100 μL的人乳樣品，脂質(zhì)覆蓋率最高。吸附和解吸時(shí)間對(duì)提取沒有影響。與脂質(zhì)組學(xué)中傳統(tǒng)的SPE和LLE相比，該法的優(yōu)點(diǎn)是可混合具有各種吸附機(jī)制的吸附劑，確保較高的脂質(zhì)體覆蓋率，并且使用的材料少（包括吸附劑和有機(jī)溶劑碳水化合物）。

除此之外，磁性固相萃?。∕SPE）同樣是傳統(tǒng)SPE的一種替代方法，MSPE以磁性或可磁化的材料作為吸附劑基質(zhì)，憑借吸附劑的超順磁性，在外界磁場(chǎng)作用下即可實(shí)現(xiàn)吸附劑與樣品溶液的分離，操作簡單、兼容性好、富集率高、快速、選擇性好，從而避免了吸附劑填料、高背壓或填料堵塞等問題。Wang等[22]采用微波輔助穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化MSPE開發(fā)了一種測(cè)定大鼠血液微透析液中含羥基膽固醇和代謝物的方法，為阿爾茨海默病的診斷和治療提供了技術(shù)支持。

近年來，越來越多的有機(jī)多孔金屬材料出現(xiàn)，特別是金屬-有機(jī)骨架材料（Metal-Organic Frameworks，MOFs）和共價(jià)-有機(jī)骨架材料（Covalent Organic Frameworks，COFs）在生物樣品分離中得到廣泛運(yùn)用[23-26]。MOFs和COFs的化學(xué)活性高，且易于進(jìn)行孔道修飾，由此發(fā)展出磁性MOFs和COFs復(fù)合材料，結(jié)合了各組分的有源性能，彌補(bǔ)了常規(guī)SPE的缺陷，有望在脂質(zhì)分析樣品前處理中展現(xiàn)出更廣闊的應(yīng)用前景。

3 其他萃取方法

研究表明：場(chǎng)效應(yīng)，如壓力、熱量、超聲和微波能量可能會(huì)提高傳質(zhì)速率，從而提高萃取率。因此，在傳統(tǒng)的LLE和SPE技術(shù)上，許多其他方法，如微超臨界流體提取法（SFE）、微波輔助提取法（MAE）、超聲輔助提取法（UAE）等已經(jīng)應(yīng)用于脂質(zhì)組學(xué)的樣品前處理中。

3.1 超臨界流體萃取法

超臨界流體是指溫度與壓力均處于臨界值以上的流體，SFE中最常用的超臨界流體是超臨界二氧化碳（SCCO2），其極性與戊烷相近，適合于疏水物質(zhì)的萃取，并且無毒害，易于去除[27]。作為一種綠色的萃取方法，微超臨界流體提取法（Supercritical Fluid Extraction，SFE）被廣泛用于從不同基質(zhì)中分離脂質(zhì)。與傳統(tǒng)的LLE方法相比，SFE具有萃取效率高、有機(jī)溶劑消耗少、通過降低壓力實(shí)現(xiàn)無溶劑提取物等優(yōu)點(diǎn)[28-29]。此外，SCCO2的惰性和低臨界溫度(31.06℃)可以防止高溫和大氣中氧氣對(duì)不穩(wěn)定化合物的潛在降解。然而，SCCO2的低極性可能導(dǎo)致極性分子的提取率降低，幸運(yùn)的是，可以通過添加極性溶劑來解決這個(gè)問題。Barbi等[30]對(duì)一種巴西本土棕櫚（Maximiliana Maripa）的果肉油樣品進(jìn)行了超臨界流體脂質(zhì)提取研究，比較了純SCCO2、SCCO2乙醇共溶劑（SCCO2+EtOH）和乙醇加壓液體萃?。≒ressurized Liquid Extraction，PLE）的提取回收率。結(jié)果表明，在333.15 K和20 MPa條件下，純SCCO2提取率較低；加入乙醇作為共溶劑，由于乙醇增加了混合溶劑的極性，使提取回收率升高了5倍多，PLE的回收率則更高。在SFE基礎(chǔ)上發(fā)展形成SFE-MS技術(shù)，由于SCCO2的極性與脂質(zhì)的極性相似，SFC-MS對(duì)SFE提取的脂類具有良好的分離能力。

3.2 微波輔助提取法

微波輔助提取法（Microwave-Assisted Extraction，MAE）是一種快速、高效的樣品制備方法，在脂質(zhì)譜中得到了廣泛的應(yīng)用[31-32]。其原理為利用離子傳導(dǎo)和偶極旋轉(zhuǎn)引起的熱效應(yīng)微波能加速萃取，使MAE更適合于熱穩(wěn)定分子的提取。在MAE中目標(biāo)分子被選擇性加熱，取決于脂質(zhì)和萃取溶劑微波吸收能力的差異，因此，MAE是一種更省時(shí)、更有效的方法。與傳統(tǒng)的LLE相比，MAE能減少溶劑的消耗。Mustapha等[31]研究了氯仿、甲醇、乙醇、二氯甲烷等混合溶劑對(duì)斜生柵藻脂質(zhì)提取的影響，采用氯仿/甲醇/乙醇/二氯甲烷混合溶劑組成（1∶5∶1∶1，V/V/V/V），與常用的氯仿-甲醇混合物組合物相比，成本較低，毒性較小，微波輔助脂質(zhì)提取法提取微藻中的脂質(zhì)回收率高達(dá)55.67%，與常規(guī)溶劑提取相比，提取的脂質(zhì)質(zhì)量不受影響。MAE的局限性在于不適用于熱不穩(wěn)定性物質(zhì)。

3.3 超聲輔助提取法

超聲輔助提取法（Ultrasonic-Assisted Extraction，UAE）是利用超聲波產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)、擴(kuò)散等效應(yīng)加速兩相間物質(zhì)傳遞，從而實(shí)現(xiàn)萃取的技術(shù)[33]。與傳統(tǒng)的提取方法如LLE相比，UAE能更有效地進(jìn)行脂質(zhì)分析，縮短脂質(zhì)提取的時(shí)間。除此之外，在UAE過程中不會(huì)升溫，有利于熱不穩(wěn)定性物質(zhì)的分析。Gulzar等[34]研究了不同預(yù)處理?xiàng)l件和氣氛對(duì)超聲波輔助提取凡納濱對(duì)蝦脂質(zhì)提取率和氧化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明，真空-微波處理與UAE聯(lián)用可提高脂質(zhì)的提取率，在超聲容器的上方吹氮，并加入單寧酸可顯著抑制脂質(zhì)的氧化和水解。將這些方法納入提取過程可以從一定程度上抑制UAE對(duì)脂質(zhì)提取的不良影響。

3.4 電遷移提取法

電遷移提取法是利用電場(chǎng)誘導(dǎo)帶電化合物的選擇性遷移進(jìn)行的，由于脂質(zhì)分子上的電荷不同，這種提取方式理論上非常適合靶向分析。電遷移提取常用的有兩種方法：電膜萃?。‥lectromembrane Extraction，EME）和電提?。‥lectroextraction，EE）[35]。EME是基于電場(chǎng)中給予相和接受相相互作用，接受相在其空隙中被一種有機(jī)溶劑制成的膜（Supported Liquid Membrane，SLM）隔開，通過聚合材料組成的液膜，分析物從樣品中萃取到接受相，并在接受相富集。EME使用液膜可以避免基質(zhì)中的雜質(zhì)，電場(chǎng)提高了萃取效率，適用于復(fù)雜生物樣本中痕量物質(zhì)的萃取，目前多用于從生物樣本中提取小分子的藥物。由于磷脂在生理pH條件下，具有兩性離子性質(zhì)，阻礙了其在電場(chǎng)中的凈遷移，無法穿過SLM，從而實(shí)現(xiàn)磷脂的分離。EE是基于電遷移的富集方法，分析物通過一個(gè)或者多個(gè)液-液界面從一個(gè)大的給予相富集到一個(gè)小的接受相。給予相電場(chǎng)強(qiáng)度高，通過液-液系統(tǒng)電場(chǎng)中的電子驅(qū)動(dòng)，代謝物進(jìn)入低電場(chǎng)的受體相并富集。EME和EE由于可以在萃取過程中對(duì)待測(cè)物進(jìn)行預(yù)富集，且易與檢測(cè)技術(shù)在線連接，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，有望用于高通量和低濃度脂質(zhì)樣品分析。但目前大多數(shù)報(bào)道都集中在小分子藥物和代謝物的提取上[36]，在脂質(zhì)提取中的應(yīng)用有待開發(fā)。

4 總結(jié)與展望

樣品制備是脂質(zhì)分析的關(guān)鍵步驟之一。脂質(zhì)組學(xué)中生物樣本前處理方法選擇對(duì)研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和檢測(cè)靈敏度至關(guān)重要。由于生物樣本種類繁多，且脂類的化學(xué)成分、極性和大小有很大差異，沒有一種方法可以保證提取樣品中所有脂質(zhì)被提取。每種方法都有其優(yōu)勢(shì)和局限性，如固相微萃取法選擇性高，但回收率較低。研究者必須認(rèn)識(shí)到各種方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性，針對(duì)不同的脂質(zhì)分析平臺(tái)開發(fā)不同的樣品制備方法。此外，脂質(zhì)穩(wěn)定性研究也應(yīng)納入方法開發(fā)的過程。新穎的前處理方法以及新型的萃取材料和試劑也值得關(guān)注，但實(shí)際應(yīng)用價(jià)值仍有待開發(fā)和檢驗(yàn)，如電遷移提取法等。研究開發(fā)更高通量、更高提取率、更簡便和綠色的分離和提取工藝仍是脂質(zhì)分析樣品前處理的主要目標(biāo)。