卵巢癌標(biāo)志物溶血磷脂酸檢測(cè)的研究進(jìn)展

李年生　陳立　肖祚庥　楊禹祺　艾可龍

摘 要 卵巢癌的死亡率高，是嚴(yán)重威脅女性健康的重大疾病。當(dāng)前，由于缺乏有效、便捷的早期診斷技術(shù)，大部分卵巢癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于中晚期而錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)。因此，對(duì)早期卵巢癌的快速、靈敏、低成本和準(zhǔn)確檢測(cè)具有非常重要的意義。在早期卵巢癌患者血液中存在溶血磷脂酸（Lysobisphosphatidic acids， LPA）濃度升高現(xiàn)象，而在其它疾病中卻較少出現(xiàn)此情況，因此LPA可作為一種高特異性、有良好臨床應(yīng)用前景的卵巢癌標(biāo)志物。近年來， 該領(lǐng)域的相關(guān)研究取得了較大的進(jìn)展， 開發(fā)了很多LPA的檢測(cè)技術(shù)和方法。本文對(duì)LPA的檢測(cè)方法進(jìn)行分類、歸納和總結(jié)，著重介紹了近年來該領(lǐng)域的重要進(jìn)展，最后對(duì)LPA標(biāo)記物檢測(cè)在臨床應(yīng)用方面所面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了分析， 對(duì)其發(fā)展和前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 卵巢癌; 溶血磷脂酸; 癌癥標(biāo)志物; 質(zhì)譜檢測(cè); 比色檢測(cè); 熒光檢測(cè); 評(píng)述

1 引 言

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性健康的疾病[1，2]。由于卵巢癌早期缺少癥狀，篩查方法有限，因此其早期診斷比較困難。75%的卵巢癌患者就診時(shí)已為晚期，而晚期病例療效不佳（晚期卵巢癌患者5年生存率僅25%）[3～6]。因此，雖然卵巢癌的發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤的第三位，但其死亡率高居?jì)D科癌癥首位。值得注意的是，早期確診的卵巢癌患者5年生存率為90%。因此，實(shí)現(xiàn)卵巢癌早期診斷，可以大幅度降低卵巢癌的死亡率。目前，臨床上卵巢癌診斷的方法主要包括影像學(xué)檢查（超聲成像、計(jì)算機(jī)斷層掃描、正電子發(fā)射斷層掃描及核磁共振成像等）、組織病理切片等。影像學(xué)檢查手段能夠明確盆腔腫塊是否存在，甚至能發(fā)現(xiàn)卵巢腫瘤，區(qū)分固體腫塊和液體囊腫，判斷腫塊的尺寸，以及觀察腫塊內(nèi)部的情況等。盡管如此，影像學(xué)檢查無法判定卵巢腫塊是良性或惡性，且其成本高、價(jià)格昂貴、普適性低。組織病理切片檢查需要通過手術(shù)切除選取標(biāo)本，制成病理切片，用顯微鏡檢查病變。病理切片是卵巢癌確診的主要手段，但其缺點(diǎn)是需要手術(shù)、創(chuàng)傷性大，且無法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶。這些影像學(xué)檢查、組織病理切片方法通常僅適用于中晚期卵巢癌病人的檢查。

通過體液檢測(cè)卵巢癌相關(guān)標(biāo)志物是更為便捷、經(jīng)濟(jì)的方法[1，7，8]。卵巢癌標(biāo)志物主要有人附睪蛋白4、癌抗原-125（Cancer antigen 125， CA-125）和間皮素等，其中CA-125在臨床上已被用于卵巢癌的篩查[9～11]。CA-125是一種糖類蛋白質(zhì)，中晚期卵巢癌患者的CA-125水平會(huì)升高，但是檢測(cè)CA-125對(duì)早期卵巢癌的篩檢并不適用，有些其它疾病或健康女性在特定生理周期也會(huì)引起血清中的CA-125水平升高。此外，在卵巢癌早期僅有25%左右的患者CA-125的水平升高[12]。因此，通過CA-125篩查早期卵巢癌具有高的假陽(yáng)性和漏診率。溶血磷脂酸（Lysobisphosphatidic acids， LPA）在卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲等方面發(fā)揮了重要作用。在卵巢癌早期，新血管增生對(duì)腫瘤的增殖至關(guān)重要。Song等[14]研究發(fā)現(xiàn)，LPA能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞高度表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor， VEGF），而VEGF能在腫瘤部位誘導(dǎo)血管新生。LPA能促使卵巢癌細(xì)胞增值轉(zhuǎn)錄因子（主要為叉頭框蛋白M1， forkhead box M1）表達(dá)，而直接誘導(dǎo)卵巢癌增殖[15]。另外，LPA能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9， MMP9）的表達(dá)，MMP9能促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移和侵襲[16]。這說明LPA在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[16～18]。據(jù)報(bào)道，卵巢癌早期患者血清中的LPA升高率達(dá)90%，而中晚期患者可達(dá)100%[19]。LPA是一種脂類物質(zhì)，易從血液、腹水、唾液等中提取，因而便于進(jìn)行分析和檢測(cè)。上述結(jié)果表明， LPA是具有臨床應(yīng)用前景的卵巢癌早期標(biāo)記物。

基于LPA檢測(cè)的重要意義，大量檢測(cè)手段、生物探針被開發(fā)用于檢測(cè)LPA[12，20～33]。本研究組也構(gòu)建了聚丁二炔比色探針檢測(cè)血清中的LPA[21]。當(dāng)前， LPA的檢測(cè)主要通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜與原子吸收光譜或質(zhì)譜聯(lián)用等方法實(shí)現(xiàn)[13，23，34～50]。這些方法具有靈敏度高、普適性好的優(yōu)勢(shì)，但缺點(diǎn)是耗時(shí)、操作復(fù)雜和成本高。LPA也可以通過熒光法、比色法和電化學(xué)發(fā)光等便捷、經(jīng)濟(jì)的方法進(jìn)行檢測(cè)，然而它們的特異性和靈敏度需要進(jìn)一步提高。近年來，由于納米技術(shù)、光譜技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，LPA檢測(cè)方法在靈敏度、特異性等方面取得了很大的進(jìn)展。本文對(duì)LPA檢測(cè)主要方法進(jìn)行分類闡述， 對(duì)相關(guān)檢測(cè)機(jī)理和影響因素進(jìn)行了深入的探討，重點(diǎn)介紹了該領(lǐng)域最新進(jìn)展，最后展望了LPA檢測(cè)在臨床應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

2 質(zhì)譜法檢測(cè)LPA

質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性高、響應(yīng)時(shí)間快、需要的樣本量少、通量高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于生物樣品的分析和檢測(cè)[51]，已經(jīng)成為生物樣品中脂質(zhì)分析的常規(guī)技術(shù)。

質(zhì)譜檢測(cè)LPA的準(zhǔn)確性主要依靠分離技術(shù)。采用質(zhì)譜檢測(cè)體液（主要包括血液、尿液、唾液等）樣本中的LPA通常按照如圖1所示的流程[13]，分8個(gè)步驟進(jìn)行。首先是樣本收集，然后經(jīng)過脂質(zhì)抽提和色譜分離后，再進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)和分析[52]。體液樣本中最普遍采用的是血液樣本。血液中LPA的豐度比溶血磷脂酰膽堿低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)還包含與LPA具有類似結(jié)構(gòu)的溶血磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿等，這些脂質(zhì)分子都會(huì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)LPA造成干擾。近年來，在LPA的抽提和分離方面的研究也取得了很大的進(jìn)展。對(duì)于抽提方法，已從傳統(tǒng)的甲醇/氯仿脂質(zhì)液-液提取法（Bligh & dyer方法）發(fā)展到固-液提取法。對(duì)于分離方法，也從早期的毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法等發(fā)展到高效液相色譜法等。目前，高效液相色譜法已經(jīng)成為分離LPA的常規(guī)方法。質(zhì)譜技術(shù)中，常規(guī)的電子碰撞電離、電噴霧電離和基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)都已被用于LPA的檢測(cè)。 本文將從抽提、分離方法和電離方式三個(gè)方面對(duì)質(zhì)譜法檢測(cè)LPA的最新進(jìn)展進(jìn)行歸納和總結(jié)。

2.1 LPA的抽提方法

通過質(zhì)譜法進(jìn)行LPA檢測(cè)時(shí)，獲得高靈敏度和高準(zhǔn)確性的最重要的一步是LPA抽提。不同于常見脂質(zhì)分子，LPA是一種兩親性分子，具有較大的極性。除了常規(guī)脂質(zhì)提取法（Bligh & Dyer方法）外，基于異丙醇、甲基叔丁基醚和丁醇等溶劑的方法也被用于提取LPA[53～56]。Triebl等[38]對(duì)比研究了Bligh & Dyer 方法、Bligh & Dyer鹽酸法、甲基叔丁基醚提取法和丁醇提取法（圖2） ，發(fā)現(xiàn)甲基叔丁基醚提取法效果較差，在提取過程中超過69%的LPA丟失;采用Bligh & Dyer 方法提取效果同樣較差，主要因?yàn)長(zhǎng)PA的強(qiáng)極性導(dǎo)致其在甲基叔丁基醚和氯仿中的溶解度不高;因HCl能導(dǎo)致LPA質(zhì)子化而提高其在非極性溶劑中的溶解度，采用HCl修改的Bligh & Dyer 方法能大幅提高LPA的提取效率（提取率在91%～99%之間）。最近，Scherer等[42]發(fā)現(xiàn)，通過Bligh & Dyer HCl方法抽提LPA時(shí)，約2%的溶血磷脂酰膽堿在酸性條件下水解生成LPA?？紤]到溶血磷脂酰膽堿在血清中的濃度比LPA高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，采用該方法會(huì)導(dǎo)致LPA水平人為升高。因LPA能在正丁醇中很好地溶解，通過正丁醇方法也能獲得較好的LPA提取效果。2019年，Aristizabal-Henao等[34]采用正丁醇抽提法不僅獲得了很好的LPA萃取效率， 且能大幅減少血樣體積，僅用50 μL血清樣本，即分離出LPA的多種異構(gòu)體。

除了液-液抽提法，固相萃取法在近年來也被用于萃取LPA。Wang等[57]使用分子印跡聚合物作為固相萃取的固定相，通過固-液抽提實(shí)現(xiàn)對(duì)LPA的高效提取。分子印跡是在固體或凝膠中產(chǎn)生印記的過程，其大小、形狀和電荷分布與模板分子相對(duì)應(yīng)[58]。通常將模板分子與功能單體通過共價(jià)或非共價(jià)鍵結(jié)合，然后再高濃度交聯(lián)聚合。去除模板后形成具有空位和目標(biāo)物結(jié)合位點(diǎn)的分子印跡聚合物，可選擇性地結(jié)合目標(biāo)分子。通過這種方法，可快速和簡(jiǎn)單地提取高純度的LPA，提取率超過94.6%，比液-液抽提法具有回收率更高、便捷和易于自動(dòng)化操作的優(yōu)點(diǎn)。

2.2 LPA的分離

高效液相色譜法廣泛應(yīng)用于生物、化學(xué)和環(huán)境等樣品分析，其核心是高效液相色譜柱[52， 59]。高效液相色譜柱一般分為正相柱和反相柱。正相色譜柱一般選擇極性的多孔球形硅膠填充。2016年， Cífková等[36]采用正相色譜柱分離LPA。通過對(duì)不同化學(xué)性質(zhì)的色譜柱、流動(dòng)相的pH值、流動(dòng)相添加劑的類型和濃度進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用氫化二氧化硅柱、酸化處理（pH 4）時(shí)，高效液相色譜能有效分離脂類物質(zhì)，可獲得血清樣品中所有脂質(zhì)類（包括LPA）良好的色譜峰形狀。

相對(duì)于正相色譜柱，反相色譜柱具有更好的分離能力和穩(wěn)定性。在反相色譜法中，極性化合物先被洗脫，而非極性化合物因與吸附劑表面的親和性不同而被依次分離。目前，反相色譜柱已經(jīng)被廣泛用于分離磷脂分子[60～62]。LPA在反相柱中通常以長(zhǎng)拖尾狀寬峰的形式被洗脫，導(dǎo)致LPA的分離、檢測(cè)和定量分析的效果較差。Ogiso等[45]通過使用含有低濃度H3PO4（5 μmol/L）和高比例水（40%）的起始流動(dòng)相，可大幅減少LPA洗脫峰的拖尾，從而高效分離LPA。流動(dòng)相中低濃度的H3PO4能促使LPA質(zhì)子化，從而減少極性而減少洗脫峰的拖尾。然而，H3PO4的引入會(huì)對(duì)隨后進(jìn)行的質(zhì)譜分析造成干擾。LPA上的羥基基團(tuán)與三甲基硅烷化重氮甲烷（Trimethylsilyl chloride， TMS）發(fā)生專一性強(qiáng)、效率高的反應(yīng)[35，40，63，64]，易被甲基化而大幅減少分子極性，使其在反相色譜柱中易被分離。最近，王雪穎等[23]通過該反應(yīng)對(duì)LPA進(jìn)行甲基化修飾（圖 3A），可大幅改善LPA的色譜行為。如圖3B和3C所示，LPA的色譜峰具有很長(zhǎng)的拖尾，而甲基化后的LPA色譜峰得到了明顯改善，色譜峰的拖尾減少，色譜峰的強(qiáng)度也大幅提高。

2.3 LPA的質(zhì)譜電離方法

在質(zhì)譜分析中，樣品電離一般在離子化器里進(jìn)行。最常見的離子化器是電子離子化器。電子離子化是一種“硬”的電離方法，采用電子離子化器能產(chǎn)生大量碎裂片段而能提供詳細(xì)的質(zhì)譜信息，可為分子結(jié)構(gòu)表征提供重要信息。電子離子化器主要通過由鎢或錸加熱燈絲產(chǎn)生的電子束與樣品氣體分子碰撞時(shí)，解離一個(gè)電子而產(chǎn)生電離。在正常大氣壓的空氣中，有機(jī)物在加熱條件下會(huì)迅速燃燒，因此電子離子化器通常與氣相色譜聯(lián)用（在真空條件下），但不能與液相色譜或高效液相色譜（一般在正常大氣壓下）聯(lián)用。

通過高效液相色譜分離LPA時(shí)，一般采用較“軟”的離子化器。電噴霧電離和基質(zhì)輔助激光解吸電離是兩種“軟”電離方法[13]。這兩種電離法通常不會(huì)或很少產(chǎn)生分子碎片。基質(zhì)輔助激光解吸電離是利用基質(zhì)吸收激光的能量使樣品中的分子以最小的碎裂度產(chǎn)生離子[65，66]。例如，Tanaka等[31]采用氮分子激光器發(fā)射337 nm的激光作為能量來源以輔助電離樣品。然而該方法重現(xiàn)性不佳，為了提高重現(xiàn)性，每個(gè)質(zhì)譜樣本需要多次激光激發(fā)（平均需采用256次）。電噴霧電離是將含有分析物的液體通過電噴霧形成精細(xì)的氣溶膠，高溫去溶劑后將分析物離子化。電噴霧電離的最大優(yōu)勢(shì)是能便捷地與液相色譜分離技術(shù)聯(lián)用。相對(duì)于基質(zhì)輔助激光解吸電離，當(dāng)前LPA的質(zhì)譜分析采用電噴霧電離更為普遍[19，67～73]。例如， Cífková等[36]通過高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜樣品豬腦和腎中的LPA的分離和定量檢測(cè)。

3 光學(xué)方法檢測(cè)LPA

對(duì)于實(shí)際臨床檢驗(yàn)來說，發(fā)展一種相對(duì)簡(jiǎn)單有效檢測(cè)LPA的方法非常必要，因此操作簡(jiǎn)便、低成本的光學(xué)方法因此受到廣泛的關(guān)注。基于光學(xué)檢測(cè)LPA的方法包括有電化學(xué)發(fā)光法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法、熒光法和比色法等[12，19，21，22，26，30，33，56，74～80]，其中， 以熒光法和比色法為主。光學(xué)方法最大的瓶頸是選擇性和靈敏度。由于體液的成分復(fù)雜，光學(xué)探針應(yīng)具有較好的抗干擾能力， 以確保對(duì)LPA的選擇性響應(yīng)。另外，卵巢癌患者血清的LPA濃度介于1.3～50 μmol/L之間，臨界值為1.3 μmol/L[19]。因此，有臨床應(yīng)用價(jià)值的光學(xué)探針需要具有很高的靈敏度，其檢出限應(yīng)低于1.3 μmol/L。近年來，LPA光學(xué)探針在靈敏度、特異性等方面取得了很大的進(jìn)展，本節(jié)對(duì)熒光法和比色法這兩種光學(xué)法進(jìn)行歸納和總結(jié)。

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Progress in Detection of Biomarker of Ovarian

Cancer： Lysophosphatidic Acid

LI Nian-Sheng， CHEN Li， XIAO Zuo-Xiu， YANG Yu-Qi， AI Ke-Long*

（Xiangya School of Pharmaceutical Sciences， Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research，

Central South University， Changsha 410078， China）

Abstract Ovarian cancer is a serious threat to women's health， and its mortality rate is the highest in gynecological cancer. At present， there is a lack of effective and convenient early diagnosis technology for ovarian cancer. Most of the patients with ovarian cancer are found in the middle and late stage and miss the best time for treatment. Therefore， the rapid， sensitive， economic， and accurate detection of early ovarian cancer is of great significance. In recent years， lysophosphatidic acid （LPA） has been found to increase in serum in the early stage of ovarian cancer， but less in other diseases. Therefore， LPA is a promising and highly specific marker of ovarian cancer. To detect LPA， many detection techniques and methods have been developed. In recent years， great progress has been made in this field. This paper summarizes the detection methods of LPA， and focuses on the important progress in this field in recent years. Finally， the challenges and prospects of LPA detection in real clinical application are also prospected.

Keywords Ovarian cancer： Lysophosphatidic acid; Biomarker; Mass spectrometry; Colorimetry; Fluorescence detection; Review

（Received 20 June 2020; accepted 14 August 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21974134） and the Innovation-Driven Project of Central South University ， China （No. 202045005）.

2020-06-20收稿; 2020-08-14接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.21974134）和中南大學(xué)創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)項(xiàng)目（No.202045005）資助

* E-mail： aikelong@csu.edu.cn