骨髓單核細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞的條件研究

★ 楊佛 楊文龍 李明慧 李威 劉璞 楊鳳云*（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

1 破骨細(xì)胞培養(yǎng)方法概述

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是影響中老年人生活的重大健康問題，它的發(fā)生與成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）和破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）的關(guān)系失衡密切相關(guān)，OB功能下降而OC功能亢進(jìn)是其發(fā)生的主要機(jī)制［1］，近年來越來越多研究表明OC功能亢進(jìn)與OP的發(fā)病更為密切［2］。OC是一種終末分化細(xì)胞，不能傳代培養(yǎng)［3-4］，對(duì)于它的培養(yǎng)一直是個(gè)難題，由此極大地限制了骨科領(lǐng)域的研究進(jìn)展。一種理想良好的OC培養(yǎng)方法對(duì)OC的研究意義重大。

OC的培養(yǎng)方法有機(jī)械分離法和誘導(dǎo)法，誘導(dǎo)法包括骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法、RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)法、脾干細(xì)胞誘導(dǎo)法、外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)法、骨髓單核細(xì)胞和成骨細(xì)胞共育誘導(dǎo)培養(yǎng)法等［5-8］。國(guó)外學(xué)者chamber等［9］首次用機(jī)械分離法培養(yǎng)出了成熟OC，國(guó)內(nèi)最早由史鳳芹等［10］運(yùn)用該方法從新西蘭大白兔長(zhǎng)骨骨髓腔內(nèi)提取細(xì)胞并培養(yǎng)出了OC。但該方法培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，得到的OC純度低［11］，隨著生物技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)逐步被其他改良的方法所取代。誘導(dǎo)劑的出現(xiàn)使OC的培養(yǎng)方法得到了極大的改善［12］，李雨民等［13］用大鼠骨髓單核細(xì)胞加1α 25-（OH）2 Vit D3成功誘導(dǎo)出了OC，曾立等［14］用C57BL/6小鼠骨髓單核細(xì)胞加巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB Ligand, RANKL）誘導(dǎo)因子成功誘導(dǎo)出了成熟OC，董強(qiáng)等［15］則用SD大鼠骨髓單核細(xì)胞加維生素D3和地塞米松成功誘導(dǎo)出了成熟OC。RAW264.7細(xì)胞株的出現(xiàn)打破了OC不能傳代的缺點(diǎn)，使OC培養(yǎng)方法得到了巨大的發(fā)展。戴閩等［16］用RAW264.7細(xì)胞加RANKL成功誘導(dǎo)出了OC，李新等［17］用RAW264.7細(xì)胞加M-CSF、RANKL、1α 25-（OH）2 Vit D3成功誘導(dǎo)出了成熟OC。

當(dāng)前大多數(shù)研究者都采用骨髓單核細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)OC，但很多人都未成功。我們?cè)谂囵B(yǎng)OC時(shí)也運(yùn)用這兩種方法進(jìn)行培養(yǎng)，一開始也遇到諸多問題導(dǎo)致誘導(dǎo)未成功，通過不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案才成功。我們發(fā)現(xiàn)在OC培養(yǎng)過程中有諸多實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)需要注意，因此本文就OC培養(yǎng)過程中的細(xì)節(jié)和步驟進(jìn)行論述，希望為研究OC的骨科同道提供指導(dǎo)和幫助。

2 材料與方法

2.1 材料 高糖DMEM培養(yǎng)基、紅細(xì)胞裂解液（北京索萊寶公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（上海依科賽公司）；M-CSF、RANKL（美國(guó)peprotech公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（貝博公司）；倒置顯微鏡（OLYMPUS CKX41）；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS IX71）。SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

2.2 方法

2.2.1 骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法 取3～4周齡SD大鼠4只，脫頸處死后放入酒精中浸泡5 min，分離雙下肢和雙上肢（保留上下關(guān)節(jié)），移入細(xì)胞超凈工作臺(tái)內(nèi)，剔除雙側(cè)股骨、脛骨、肱骨軟組織（軟組織盡量剔干凈），剪斷雙側(cè)干骺端，將長(zhǎng)骨浸泡在DMEM中，用無菌剪刀縱行剪開骨干，用刀片刮出骨髓腔中的細(xì)胞（刮至骨髓腔變白），用移液槍將刮出的細(xì)胞懸液吹打混勻，用細(xì)胞篩將得到的細(xì)胞懸液過濾，裝入15 mL的離心管中以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，離心后棄上清，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用移液槍吹打混勻，放入冰中孵育7 min，7 min后以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，棄上清，加入4 mL 10 %FBS重懸，將細(xì)胞懸液吸入培養(yǎng)皿中，放入CO2培養(yǎng)箱（37 ℃，5 %CO2）中培養(yǎng)24 h，24 h后取上清液離心（1 000 r/min，3 min），離心后重懸，加入含M-CSF（50 ng/mL）的10 %FBS培養(yǎng)，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，48 h后棄上清，用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮下，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，棄上清，用血小球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞量將細(xì)胞接種至6孔板中，再加入含M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）的10 %FBS誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2 d半量換液，直到鏡下觀察見大量體積較大的多核細(xì)胞時(shí)行TRAP染色。

2.2.2 RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)法 從-80 ℃冰箱或液氮罐中取出裝有RAW264.7細(xì)胞的凍存管，在37 ℃水浴鍋中迅速搖晃數(shù)次，待管中冰晶溶解后迅速將凍存管中細(xì)胞懸液抽入裝有4 mLDMEM的管中，用移液槍吹打幾次，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，棄上清，加入4 mL 10 %FBS培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80 %～90 %時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞刮進(jìn)行傳代。傳代時(shí)先棄去舊培養(yǎng)液，用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）清洗培養(yǎng)瓶2遍，加入4 mL高糖DMEM，用細(xì)胞刮沿一定方向?qū)⒓?xì)胞輕柔刮下，刮細(xì)胞時(shí)應(yīng)保證底部細(xì)胞有DMEM浸潤(rùn)，刮完后收集細(xì)胞懸液，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，棄上清，加入2 mL 10 %FBS重懸，用移液槍吹打混勻，再?gòu)闹谐槌?0 μL細(xì)胞母液加入90 μL的DMEM中進(jìn)行稀釋，再?gòu)南♂尯蟮?00 μL細(xì)胞懸液中抽取10 μL滴入蓋玻片內(nèi)，用血小球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后按每孔1×105個(gè)數(shù)量接種細(xì)胞至6孔板中培養(yǎng)，加入含M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）的10%FBS誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2 d半量換液，直到鏡下見大量體積較大的多核細(xì)胞時(shí)行TRAP染色。

2.2.3 TRAP染色及計(jì)數(shù) 骨髓單核細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)5d后鏡下見大量成熟OC時(shí)行TRAP染色，染色步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)TRAP陽(yáng)性且細(xì)胞核數(shù)量≥3的細(xì)胞。

2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

3 結(jié)果

3.1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

3.1.1 骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法 從SD大鼠骨髓腔中提取的細(xì)胞經(jīng)紅細(xì)胞裂解后呈小圓形，顏色透亮，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后可見較多細(xì)胞貼壁，加入M-CSF誘導(dǎo)后細(xì)胞體積增大，細(xì)胞伸出偽足，加入RANKL共同誘導(dǎo)后細(xì)胞偽足增多，分化明顯，M-CSF和RANKL共同誘導(dǎo)4 d時(shí)可見體積較小的OC形成，OC顏色較暗，5 d時(shí)OC體積增大，6 d時(shí)OC體積最大，8 d時(shí)OC體積減小，開始出現(xiàn)凋亡（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法培養(yǎng)OC的形態(tài)變化（200×）

3.1.2 RAW264.7誘導(dǎo)法 正常RAW264.7細(xì)胞呈圓形或類圓形、顏色透亮，加入M-CSF和RANKL誘導(dǎo)3 d后細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長(zhǎng)且伸出偽足，誘導(dǎo)第4 d時(shí)鏡下可見體積較小的多核OC形成，OC顏色較暗，第5 d時(shí)OC數(shù)量增多，OC細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見大量細(xì)胞核，同時(shí)可見許多懸浮的RAW264.7細(xì)胞，第6 d時(shí)融合的OC繼續(xù)增多（圖2）。

圖2 倒置顯微鏡下RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)OC的形態(tài)變化（400×）

3.2 TRAP染色

3.2.1 骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法誘導(dǎo)原代OC染色 TRAP染色鏡下可見體積較大的成熟OC，細(xì)胞核深染，邊界清楚，同時(shí)可見散在的體積較小的OC，細(xì)胞核可達(dá)數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)（圖3-4）。

圖3 原代OC TRAP染色（40×）

圖4 原代OC TRAP染色（100×）

3.2.2 RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)OC染色 TRAP染色鏡下觀察見大量體積較大的OC，可見核呈深染，細(xì)胞核可達(dá)數(shù)十個(gè)（圖5-6）。

圖5 RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)5d TRAP染色（40×）

圖6 RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)5d TRAP染色（100×）

3.2.3 骨髓單核細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)OC TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)如下表所示，總體而言RAW264.7組TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于骨髓單核細(xì)胞組（見表1）。

表1 骨髓單核細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（±s，n=4）

表1 骨髓單核細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（±s，n=4）

分組 TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（n=4）40× 100×骨髓單核細(xì)胞 6±2.2 3±1.2 RAW264.7細(xì)胞 15±1.5 4±1.8

4 討論

筆者采用骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法和RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)法均培養(yǎng)出了體積較大且TRAP染色陽(yáng)性的成熟OC。但在整個(gè)培養(yǎng)過程中要注意幾個(gè)技術(shù)要點(diǎn)，這幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是決定能否成功培養(yǎng)出OC的關(guān)鍵。

4.1 細(xì)胞純化 該問題主要與骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法培養(yǎng)OC有關(guān)。因?yàn)楣撬枨粌?nèi)細(xì)胞種類很多，有紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等［18］，單核細(xì)胞是誘導(dǎo)OC的關(guān)鍵細(xì)胞，但它在骨髓腔中數(shù)量極少，如果不進(jìn)行純化則很難形成OC［13］，筆者在剛開始培養(yǎng)OC時(shí)未注意到該要點(diǎn)導(dǎo)致OC誘導(dǎo)一直不成功，因此對(duì)于單核細(xì)胞的純化尤為重要。具體操作細(xì)節(jié)是在刮出骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞后進(jìn)行離心，離心之后肉眼可見一紅色團(tuán)塊，然后加入紅細(xì)胞裂解液將紅細(xì)胞裂解，再利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁速度快的特點(diǎn)，將去除紅細(xì)胞的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基本貼壁，此時(shí)取上清液進(jìn)行離心即可得到單核細(xì)胞。離心后再加入含M-CSF（50 ng/mL）的10 %FBS誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d，因M-CSF能特異性促進(jìn)骨髓單核細(xì)胞增殖，因此2 d后貼壁的細(xì)胞大多是單核細(xì)胞，2 d后將單核細(xì)胞傳代，按照一定的密度種植到培養(yǎng)瓶或6孔板中即可進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)研究。而淋巴細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，它存在于細(xì)胞上清中，所以可以通過換液將其去除，因此，通過該方法可以得到高純度的單核細(xì)胞，再在該基礎(chǔ)上加入兩種誘導(dǎo)因子就能得到高純度的OC。

4.2 傳代方法 無論是骨髓單核細(xì)胞還是RAW264.7細(xì)胞的傳代，細(xì)胞刮刀都是最為推薦使用的方法。因?yàn)檫@兩種細(xì)胞都有貼壁性強(qiáng)的特點(diǎn)［19］，用0.25 %的胰酶難以將其消化下來。筆者曾用0.25 %胰酶消化液（含EDTA）消化10min都未將單核細(xì)胞消化下來，還因此導(dǎo)致了大量單核細(xì)胞的損失。而細(xì)胞刮刀可將大部分細(xì)胞刮下來，比胰酶消化法獲得的細(xì)胞數(shù)量多，最大程度的避免了細(xì)胞的損失。在使用細(xì)胞刮傳代時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，且在操作過程中瓶?jī)?nèi)要保證有DMEM浸潤(rùn)，防止在刮細(xì)胞過程中貼壁的細(xì)胞失水皺縮，進(jìn)而影響細(xì)胞活力和功能。

4.3 誘導(dǎo)因子的濃度 在利用骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)OC時(shí)需要兩種誘導(dǎo)因子（M-CSF和RANKL）共同誘導(dǎo)，筆者注意到缺少M(fèi)-CSF則骨髓單核細(xì)胞不再增殖。RAW264.7細(xì)胞是Abelson鼠白血病病毒誘導(dǎo)BALB/c生成腫瘤后，收集小鼠腹水中單核樣巨噬細(xì)胞得到的細(xì)胞株，其實(shí)質(zhì)是破骨前體細(xì)胞［20］。有文獻(xiàn)表明其自身可分泌M-CSF，在用RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)OC時(shí)可以不加M-CSF［21-22］。筆者在實(shí)驗(yàn)中對(duì)加與不加M-CSF兩種條件都進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)只加RANKL的組在OC的形成時(shí)間上與加M-CSF、RANKL兩種因子的組接近，大約4 d左右形成OC，但加了兩種誘導(dǎo)因子的組形成的OC數(shù)量多，且體積更大。因此筆者建議在用RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)OC時(shí)加入M-CSF和RANKL雙因子共同誘導(dǎo)。除了M-CSF濃度影響OC形成外，RANKL濃度也影響OC形成，影響甚至更大。筆者在實(shí)驗(yàn)中對(duì)RANKL兩種濃度進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）組比M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（50 ng/mL）組誘導(dǎo)形成OC的概率高，M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（50 ng/mL）誘導(dǎo)形成OC所需時(shí)間長(zhǎng)。因此推薦的濃度是M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）。通過該濃度培養(yǎng)4d左右可見小的OC形成，5 d可見較大的OC，6 d最多。因此加入細(xì)胞因子后誘導(dǎo)培養(yǎng)5～6 d就要進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，否則OC會(huì)較少甚至凋亡。

4.4 細(xì)胞的種植密度 細(xì)胞的種板密度對(duì)成功誘導(dǎo)OC同樣重要。種植密度太高、太低都會(huì)導(dǎo)致OC形成較少，甚至無法形成OC［23］。其原因可能是種植密度太高，細(xì)胞所需要的細(xì)胞因子也較多，而如果細(xì)胞間的空隙較少，細(xì)胞則沒有足夠的空間和營(yíng)養(yǎng)來達(dá)到形成OC的條件；種植密度太少則細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，誘導(dǎo)形成的OC少。筆者通過實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)用骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法在6孔板上每孔種植2×105個(gè)細(xì)胞量是較合適的細(xì)胞數(shù)量，而RAW264.7細(xì)胞6孔板上每孔種植1×105個(gè)細(xì)胞量比較適合，能形成較多OC。RAW264.7細(xì)胞在同一種植面積下種植細(xì)胞數(shù)量少于骨髓單核細(xì)胞，究其原因，可能在于RAW264.7增殖速度快，種板后誘導(dǎo)5 d左右就能形成OC，因此種植數(shù)量要小于骨髓單核細(xì)胞。

4.5 細(xì)胞狀態(tài) 主要是指RAW264.7細(xì)胞，RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度快，所需營(yíng)養(yǎng)旺盛，因此一般1～2 d換液一次［24］，如果細(xì)胞因缺乏營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)胞活力較差時(shí)，則不能傳代種板，如果此時(shí)傳代則會(huì)產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片，細(xì)胞存活率較低，影響誘導(dǎo)效果，甚至導(dǎo)致無OC形成，這樣會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子的浪費(fèi)。因此種板前一定要仔細(xì)觀察，待細(xì)胞狀態(tài)好、顏色透亮?xí)r才能進(jìn)行。具體誘導(dǎo)培養(yǎng)要點(diǎn)見表2。

表2 骨髓單核細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)OC技術(shù)要點(diǎn)

5 總結(jié)與展望

骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法和RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)法均能誘導(dǎo)形成體積較大，TRAP染色陽(yáng)性的多核OC。這兩種方法誘導(dǎo)形成OC的時(shí)間相近，都是4 d開始出現(xiàn)較小OC，5～6 d出現(xiàn)體積較大的OC。總體而言，加上細(xì)胞純化的時(shí)間骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法培養(yǎng)OC的時(shí)間長(zhǎng)于RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)法，且骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法操作過程復(fù)雜，而形成的OC數(shù)量少于RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)法，同時(shí)該方法需要大量的大鼠才能獲得較充足的骨髓單核細(xì)胞，因此如果要進(jìn)行后期的Western Blot和qPCR實(shí)驗(yàn)使用該方法成本較高。而RAW264.7細(xì)胞可以傳代和凍存，增殖速度快，誘導(dǎo)形成的OC數(shù)量多，即使是進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)研究也有足夠的數(shù)量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，長(zhǎng)遠(yuǎn)來看成本要低于骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法。盡管如此，骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法同樣具有其優(yōu)點(diǎn)，該方法是直接從大鼠骨髓腔中提取細(xì)胞進(jìn)而誘導(dǎo)培養(yǎng)形成OC的，該方法獲得的OC與人體OC生存條件類似，通過該方法研究得出的結(jié)論更具說服力，可信度高，意義更大。

自1982年chamber應(yīng)用機(jī)械分離法首次培養(yǎng)出OC到現(xiàn)在已過去30余年，OC培養(yǎng)方法在此期間也得到了不斷的改良和完善，特別是誘導(dǎo)劑的問世和細(xì)胞株的出現(xiàn)填補(bǔ)了OC相關(guān)領(lǐng)域大量的空白，使得OC研究領(lǐng)域得到了較大的發(fā)展。盡管如此，誘導(dǎo)劑價(jià)格高以及RANKL用量大的問題卻限制著OC研究的發(fā)展，希望隨著科技的發(fā)展和生化技術(shù)的進(jìn)步這些問題能逐一解決。