β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的阿爾茨海默病小鼠模型中BDNF通過上調(diào)TRPC3發(fā)揮神經(jīng)保護作用

李爽，張麗艷，李雪建，周義，金戈

（沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室；2.藥理學(xué)教研室，沈陽 110034）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙以及神經(jīng)元受損為特征的神經(jīng)退行性疾病，病理表現(xiàn)為老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)形成和突觸功能障礙等［1］。AD發(fā)病機制復(fù)雜，在眾多假說里，β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）異常沉積占主導(dǎo)地位［2-3］。最近有研究表明，在多種疾病模型中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）通過參與神經(jīng)元成熟和突觸重塑發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用［4-5］。在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因型AD小鼠中，大腦皮層和海馬區(qū)BDNF的表達量低于野生型小鼠，并伴隨著神經(jīng)元凋亡和空間學(xué)習(xí)記憶能力減弱［6］。在本課題組的前期研究［7］中，Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠模型BDNF表達下降，外源性給予BDNF后認(rèn)知功能改善。這些數(shù)據(jù)表明，BDNF在AD模型中發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用，但其作用機制尚不清楚。經(jīng)典瞬時受體電位通道（canonical transient receptor potential channel，TRPC）家族成員TRPC3在平滑肌、大腦和小腦組織高度表達。有研究［8］報道，在小鼠胚胎干細胞的分化過程中，TRPC3對神經(jīng)元的存活、多能性和分化方面有重要作用。在癲癇大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)BDNF和TRPC3的表達增加，減輕了癲癇引起的細胞損傷和癲癇發(fā)作［9］。在心肌梗死大鼠模型中，BDNF/酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）通過調(diào)控TRPC3/6通道，減輕心肌缺血損傷，抑制心肌細胞凋亡［10］。這些數(shù)據(jù)表明，BDNF可能通過TRPC3通路發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用。本課題組的前期研究［7］表明，在Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠模型中，外源性給予BDNF后TRPC3表達增加且認(rèn)知功能改善，但BDNF與TRPC3的相互關(guān)系尚需進一步確定。本研究通過建立AD小鼠模型，內(nèi)源性激活BDNF，上調(diào)、下調(diào)TRPC3的表達，觀察小鼠的行為學(xué)和神經(jīng)突觸功能，明確BDNF是否通過TRPC3改善AD小鼠的認(rèn)知功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物分組和處理：80只5周齡雄性費城癌癥研究所小鼠（購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司），體質(zhì)量20～24 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，隨機分為對照組、AD組、AD+TrkB受體激動劑7，8-二羥基黃酮（7，8-dihydroxyflavone，7，8-DHF）組（AD+7，8-DHF組）、AD+TRPC3激動劑二酰基甘油類似物（1-oleoyl-2-acetyl-snglycerol，OAG）組（AD+OAG組）和AD+7，8-DHF+TRPC3抑制劑吡唑化合物（pyrazole compound，Pyr3）組（AD+7，8-DHF+Pyr3組），每組16只。第6天對照組小鼠給予滅菌生理鹽水側(cè)腦室注射，其他4組小鼠給予Aβ1-42側(cè)腦室注射，建立動物模型。待小鼠恢復(fù)體力后，AD+7，8-DHF組、AD+OAG組 和AD+7，8-DHF+Pyr3組分別給予7，8-DHF（5 mg/kg）、OAG（0.6 mg/kg）、7，8-DHF（5 mg/kg）和Pyr3（0.1 mg/kg）腹腔注射［11-13］，每日給藥1次，連續(xù)給藥21 d后分離小鼠的海馬組織和全腦。TrkB受體激動劑7，8-DHF用于內(nèi)源性激活BDNF信號傳導(dǎo)途徑［14］，TRPC3激動劑OAG和TRPC3抑制劑Pyr3分別用于上調(diào)和下調(diào)TRPC3的表達。

1.1.2 試劑：Aβ1-42和鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ-α（calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ-α，CaMKⅡ-α）兔單克隆抗體（英國Abcam公司）；7，8-DHF（大連美倫生物）；OAG和Pyr3（美國Cayman公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天公司）；TRPC3兔多克隆抗體（臺灣Arigo公司）；synapsin-Ⅰ兔單克隆抗體（美國Cell 公司）；β-actin小鼠單克隆抗體和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（中國Boster生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 AD模型制備：將Aβ1-42溶于DMSO中，終濃度控制在0.3%（用無菌生理鹽水稀釋），然后在37 ℃溫箱中孵育120 h。根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜（第2版）確定側(cè)腦室注射位點為前囟后0.5 mm，中線向右旁開1.1 mm。用微量注射器緩慢注射Aβ1-42 3 μL，注射速度為0.6 μL/min，留針5 min。

1.2.2 Morris水迷宮實驗：Morris水迷宮是評估小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶的經(jīng)典測試［15］。水迷宮實驗（中國上海吉良軟件技術(shù)有限公司）從造模后第16天開始，持續(xù)6 d。圓形水池中裝滿黑色墨水，平臺固定在水池的第三象限，水位在平臺上1 cm處，水溫保持在（25±1）℃。水迷宮實驗包括定位航行實驗（前5 d）和空間探索實驗（第6天），分別測量小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。前5 d，將小鼠面對水池壁于不同的象限放入水中，尋找隱藏的平臺，每日3次。第6天，將平臺移走，觀察小鼠在1 min內(nèi)的動作軌跡。

1.2.3 ELISA：使用ELISA試劑盒（臺灣Arigo公司），利用酶標(biāo)儀測量海馬中Aβ1-42的濃度（n=6）。Aβ1-42濃度（ng/mL）=樣品濃度×稀釋倍數(shù)。

1.2.4 Western blotting：海馬組織中加入含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液吹打混勻后進行超聲處理，處理完后冰上靜置0.5 h，高速離心10 min。取少量上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，剩余上清液加蛋白緩沖液進行100 ℃沸水浴變性。取30 μg變性后的蛋白溶液上樣于5%SDS-聚丙烯凝膠中，室溫下電泳2 h，4 ℃下用轉(zhuǎn)膜儀（中國天能公司）將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜1 h。將膜浸泡在含有5%脫脂牛奶的TBST中，搖床上室溫封閉1.5 h，TBST漂洗3次，每次15 min。之后分別與TRPC3小鼠多克隆抗體（1∶500）、synapsin-Ⅰ（1∶2 000）、CaMKⅡ-α（1∶10 000）和β-actin（1∶1 500）4 ℃孵育過夜。第2天，TBST 漂洗3次，4 ℃搖床上與辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG（1∶5 000）孵育2 h，TBST漂洗3次。最后，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國天能公司）進行ECL顯影并用Image J軟件進行條帶灰度的定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激活BDNF和TRPC3對AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用

水迷宮實驗結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，AD組小鼠第5天逃避潛伏期延長（P＜0.001），第6天目標(biāo)象限停留時間減少（P＜0.001），第6天穿越平臺次數(shù)減少（P＜0.05），結(jié)果表明，AD組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。與AD組小鼠相比，AD+7，8-DHF組和AD+OAG組小鼠第5天逃避潛伏期縮短（P＜0.01），第6天目標(biāo)象限停留時間增加（P＜0.01），第6天穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.05），結(jié)果表明，內(nèi)源性激活BDNF和上調(diào)TRPC3后，AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力得到明顯改善。見表1。

2.2 激活BDNF和TRPC3能夠減輕Aβ1-42異常沉積

采用ELISA檢測各組海馬Aβ1-42濃度，對照組、AD組小鼠、AD+OAG組、AD+7，8-DHF組和AD+7，8-DHF+Pyr3組小鼠Aβ1-42濃度分別為（271.1±34.03）、（837.9±66.09）、（523.6±79.29）、（458.7±59.37）、（954.8±23.19）pg/mL。與對照組相比，AD組小鼠Aβ1-42濃度增高（P＜0.001）；與AD組小鼠相比，AD+7，8-DHF組和AD+OAG組小鼠Aβ1-42濃度降低（均P＜0.01）。結(jié)果表明，激活BDNF和TRPC3減輕了Aβ1-42的異常沉積。

表1 Morris水迷宮實驗中各組小鼠行為學(xué)檢測結(jié)果Tab.1 Behavioral results of mice in each group in the Morris water maze test

2.3 激活BDNF和TRPC3促進突觸相關(guān)蛋白synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α的表達

Western blotting結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，AD組小鼠TRPC3、突觸相關(guān)蛋白（synapsin-Ⅰ、CaMKⅡ-α）表達均降低（分別為P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001），表明AD組小鼠神經(jīng)突觸功能受損。與AD組小鼠相比，AD+7，8-DHF組和AD+OAG組小鼠TRPC3、突觸相關(guān)蛋白（synapsin-Ⅰ、CaMKⅡ-α）表達均增加（分別為P＜0.01，P＜0.001，P＜0.01），表明激活BDNF和TRPC3明顯改善神經(jīng)突觸功能。見圖1、表2。

2.4 BDNF通過上調(diào)TRPC3減輕Aβ沉積進而改善AD小鼠的認(rèn)知和神經(jīng)突觸功能

水迷宮實驗結(jié)果顯示，與AD+7，8-DHF組小鼠相比，AD+7，8-DHF+Pyr3組小鼠第5天逃避潛伏期延長（P＜0.001），第6天目標(biāo)象限停留時間減少（P＜0.01），第6天穿越平臺次數(shù)減少（P＜0.05），結(jié)果表明，抑制TRPC3表達降低了BDNF對AD小鼠認(rèn)知功能的改善作用。見表1。

圖1 Western blotting檢測各組小鼠海馬區(qū)TRPC3、synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α蛋白表達Fig.1 Expression of TRPC3，synapsin-Ⅰ，and CaMKⅡ-α proteins in the hippocampus of mice in each group detected using Western blotting

ELISA結(jié)果顯示，與AD+7，8-DHF組小鼠相比，AD+7，8-DHF+Pyr3組小鼠Aβ1-42濃度顯著降低（P＜0.001），結(jié)果表明，抑制TRPC3表達降低了BDNF對AD小鼠中Aβ1-42沉積的清除作用。

Western blotting結(jié)果顯示，與AD+7，8-DHF組小鼠相比，AD+7，8-DHF+Pyr3組小鼠TRPC3、synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α蛋白表達均降低（分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），結(jié)果表明，抑制TRPC3表達降低了BDNF對AD小鼠神經(jīng)突觸功能改善作用。見表2。

以上結(jié)果表明，BDNF通過上調(diào)TRPC3的表達減輕了Aβ異常沉積，進而改善AD小鼠的認(rèn)知和神經(jīng)突觸功能。

3 討論

已有研究［16-17］報道，BDNF在AD模型中表達下降，上調(diào)BDNF后AD模型認(rèn)知和神經(jīng)突觸功能得到改善，但TRPC3對AD的認(rèn)知和神經(jīng)突觸功能的作用未見報道。本課題組的前期研究［7］發(fā)現(xiàn)，AD大鼠中BDNF和TRPC3蛋白表達降低，側(cè)腦室注射BDNF后TRPC3表達增加，認(rèn)知功能得到改善。本研究中，AD小鼠TRPC3表達降低，給予7，8-DHF（內(nèi)源性激活BDNF）后TRPC3表達增加，與之前的研究結(jié)果一致。給予OAG（激活TRPC3）后TRPC3表達增加，AD小鼠認(rèn)知和神經(jīng)突觸功能改善，說明TRPC3具有改善AD小鼠認(rèn)知和神經(jīng)突觸功能的作用。另外，上調(diào)BDNF后AD小鼠的認(rèn)知和神經(jīng)突觸功能得到改善，但抑制TRPC3通道后再上調(diào)BDNF，AD小鼠認(rèn)知和神經(jīng)突觸功能并未得到改善，說明BDNF通過上調(diào)TRPC3的表達來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

表2 各組小鼠海馬區(qū)TRPC3、synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α蛋白的相對表達量Tab.2 Relative expression of TRPC3，synapsin-Ⅰ，and CaMKⅡ-α proteins in the hippocampus of mice in each group

Aβ是由β淀粉樣蛋白前體蛋白水解而成，其在腦內(nèi)異常沉積形成老年斑。老年斑是AD的主要病理變化，也是神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵因素［18］。本研究中，上調(diào)BDNF和TRPC3均使AD小鼠Aβ沉積減輕，而使用TRPC3抑制劑上調(diào)BDNF并沒有減輕Aβ沉積，說明BDNF可能通過TRPC3清除Aβ沉積，從而達到神經(jīng)保護作用。但TRPC3通過何種途徑清除Aβ沉積，具體機制并不清楚。目前，Aβ主要通過血腦屏障和腦血管周隙-淋巴2種途徑進行清除［19-20］。但有研究［21］報道，缺氧模型中TRPC通過鈣離子內(nèi)流導(dǎo)致血腦屏障受損。因此，TRPC3是否影響血腦屏障以及是否通過血腦屏障清除Aβ沉積，尚需進一步研究證明。

已有研究報道，在急性心肌梗死大鼠模型中BDNF/TrkB通過TRPC3通道抑制缺血引起的心肌細胞凋亡［10］。嗅鞘細胞的遷移對神經(jīng)再生和嗅覺發(fā)育至關(guān)重要。WANG等［22］發(fā)現(xiàn)BDNF通過TRPC3促進嗅鞘細胞的遷移。然而，ARAVAMUDAN等［23］認(rèn)為，TRPC3/6正向調(diào)控BDNF的釋放，在哮喘患者氣道平滑肌細胞中，以RNA干擾技術(shù)檢測到TRPC3/6通過調(diào)控BDNF的分泌來調(diào)節(jié)氣道平滑肌的變化。這些證據(jù)說明，BDNF和TRPC3具有協(xié)同作用，但具體機制有待進一步探討。

綜上所述，本研究表明，BDNF/TrkB通過調(diào)節(jié)AD小鼠海馬中TRPC3的表達，減輕Aβ的沉積，從而發(fā)揮其對AD小鼠認(rèn)知功能和突觸功能障礙的改善作用。BDNF和TRPC3激動劑可能成為AD治療的候選藥物。