外周血NK及NKG2C+NK細(xì)胞比例變化與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系

劉倩，侯悅，金大中，喬寵

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.遼寧省母胎醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 本溪 117000；3.遼寧省高校婦產(chǎn)科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 本溪 117000）

我國將3次及3次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA），但《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)專家共識(shí)》［1］中指出連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)即應(yīng)重視并予評(píng)估，因其再次出現(xiàn)流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)與3次者相近。RSA病因復(fù)雜，約半數(shù)患者存在免疫功能紊亂，自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞數(shù)量、功能及表面受體的表達(dá)被認(rèn)為與RSA的發(fā)生密切相關(guān)［2-3］。NKG2C作為NK細(xì)胞的活化性受體，激活后可引起細(xì)胞殺傷能力升高，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞及感染起抑制作用［4-5］，目前尚未見其在RSA中的研究。本研究擬通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RSA患者外周血NK及NKG2C+NK細(xì)胞百分比變化，探討NK細(xì)胞及其受體NKG2C與RSA的相關(guān)性，為RSA的免疫學(xué)機(jī)制研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2018年9月至2019年11月就診于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科門診的早孕期RSA患者（57例）及孕6～12周正常孕婦（30例，正常對(duì)照組）。將RSA患者根據(jù)此次妊娠胚胎是否丟失分為RSA流產(chǎn)組（15例）與RSA妊娠組（42例）。RSA流產(chǎn)組年齡 24～41歲，體質(zhì)量指數(shù)20.83～30.30 kg/m2，流產(chǎn)時(shí)孕 6～12周；RSA妊娠組年齡22～43歲，體質(zhì)量指數(shù)16.02～30.11 kg/m2；對(duì)照組年齡22～41歲，體質(zhì)量指數(shù)17.81～31.25 kg/m2。3組年齡、體質(zhì)量指數(shù)、孕周均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性，見表1。

RSA組納入標(biāo)準(zhǔn)為與同一性伴侶于20周前連續(xù)發(fā)生≥2次的自然流產(chǎn)，排除雙方存在染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異?？赡軐?dǎo)致的流產(chǎn)，排除女方存在生殖器官解剖異常及生殖道炎癥，排除慢性高血壓、心臟病、內(nèi)分泌異常、自身免疫性疾病、病毒感染等因素引起的流產(chǎn)；正常對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)為既往無自然流產(chǎn)史及異常生育史，此次妊娠無異常陰道流血，超聲提示正常宮內(nèi)妊娠，可探及妊娠囊及胎心，胎芽與孕周相符，未見宮腔積液，既往健康無任何基礎(chǔ)疾病。3組患者均于早孕期門診就診時(shí)抽取肘靜脈血。本研究已獲得研究對(duì)象知情同意，并獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

表1 3組一般資料（）Tab.1 General data of three groups（）

表1 3組一般資料（）Tab.1 General data of three groups（）

BMI，body mass index.

1.2.1 儀器與試劑：FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）；PerCP/Cy5.5-CD3（批號(hào)317336，美國Biolegend公司）；FITC-CD56（批號(hào)562794，美國BD公司）；PE-CY7-CD16（批號(hào)557744，美國BD公司）；APC-NKG2C（批號(hào)FAB138A，美國R&D公司）；溶血素（批號(hào)5154719，美國BD公司）。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)：用EDTA抗凝管采集研究對(duì)象外周血，暫存于4 ℃待檢。在流式管中加入混合單克隆熒光抗體（包括PerCP-Cy5.5-CD3抗體、FITCCD56抗 體、PE-CY7-CD16抗體、APC-NKG2C抗體），吸取抗凝管內(nèi)外周血100 μL加入流式管振蕩混勻，避光孵育15 min后，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，振蕩混勻裂解10 min，PBS洗滌2次，加入300 μL PBS溶液重懸震蕩，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用流式數(shù)據(jù)分析軟件flowjo-v10分析外周血流式數(shù)據(jù)，結(jié)果以陽性率（%）表示。本研究用CD3、CD56、CD16進(jìn)行外周血NK細(xì)胞的圈門實(shí)驗(yàn)，首先根據(jù)前向角、側(cè)向角來確定淋巴細(xì)胞區(qū)域，再根據(jù)CD3-CD56+確定NK細(xì)胞大致區(qū)域，根據(jù)CD56表達(dá)強(qiáng)弱及CD16分為CD56brightCD16-及CD56dimCD16+亞群，見圖1。

圖1 外周血NK細(xì)胞圈門策略Fig.1 Peripheral blood NK cell gating strategy

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

RSA流產(chǎn)組總NK細(xì)胞百分比顯著高于RSA妊娠組及正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；RSA流產(chǎn)組NK細(xì)胞CD56dimCD16+亞群雖高于RSA妊娠組及正常對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；RSA流產(chǎn)組NK細(xì)胞CD56brightCD16-亞群低于RSA妊娠組及正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；RSA流產(chǎn)組NKG2C+NK細(xì)胞百分比較RSA妊娠組及正常對(duì)照組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

NK細(xì)胞是人體的固有免疫細(xì)胞，在機(jī)體遇到外來刺激時(shí)無需抗原刺激即可發(fā)揮免疫作用［6］。人類NK細(xì)胞根據(jù)表面標(biāo)志可分為CD56dimCD16+及CD56brightCD16-亞群［7］，外周血中約90%的NK細(xì)胞為CD56dimCD16+表型，行使免疫監(jiān)視與免疫殺傷作用，而僅有不足10%的NK細(xì)胞為CD56brightCD16-表型，通過分泌細(xì)胞因子行使免疫營養(yǎng)與免疫保護(hù)作用。目前，國內(nèi)外關(guān)于外周血NK細(xì)胞數(shù)量改變與RSA之間聯(lián)系的相關(guān)研究結(jié)果具有較大爭議，大部分研究［8-9］發(fā)現(xiàn)RSA患者總NK細(xì)胞數(shù)量較正常孕婦高，但也有研究認(rèn)為NK細(xì)胞在RSA中的作用主要體現(xiàn)在細(xì)胞功能上，而不是體現(xiàn)在細(xì)胞總數(shù)上。目前關(guān)于NK細(xì)胞亞群CD56dimCD16+、CD56brightCD16-與RSA之間關(guān)系的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，RSA流產(chǎn)患者外周血總NK細(xì)胞數(shù)量明顯高于RSA妊娠患者（P＜0.05），與正常早孕期孕婦相比，雖然數(shù)值較高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而RSA妊娠患者外周血總NK細(xì)胞數(shù)量與正常早孕期孕婦相比稍低（P＞0.05）。KING等［8］也發(fā)現(xiàn)RSA流產(chǎn)患者外周血總NK細(xì)胞數(shù)量高于正常妊娠組，與本研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，RSA患者若此次早孕期未發(fā)生自然流產(chǎn)，其外周血NK細(xì)胞數(shù)量將保持較低水平，甚至略低于正常早孕期孕婦。說明RSA患者自然流產(chǎn)的發(fā)生與NK細(xì)胞數(shù)量增加關(guān)系密切，通過改變NK細(xì)胞的數(shù)量，也許能夠避免NK細(xì)胞增多型RSA患者繼續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)事件。本研究還對(duì)NK細(xì)胞CD56dimCD16+及CD56brightCD16-細(xì)胞亞群進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)RSA流產(chǎn)患者外周血CD56dimCD16+NK細(xì)胞比例高于RSA妊娠患者及正常早孕期孕婦，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD56dimCD16+NK細(xì)胞在外周血中發(fā)揮細(xì)胞殺傷毒性作用，其比例增高說明外周血NK細(xì)胞殺傷功能是RSA患者發(fā)生自然流產(chǎn)的重要因素，KARAMI等［10］也發(fā)現(xiàn)CD56dimNK細(xì)胞比例在RSA及人工授精失敗患者中增高，與本研究結(jié)果一致。但由于本研究中納入的RSA流產(chǎn)患者較少，故未能發(fā)現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，RSA妊娠患者外周血CD56brightCD16-NK細(xì)胞比例明顯高于正常早孕期孕婦。CD56brightCD16-NK細(xì)胞約占外周血NK細(xì)胞的不足10%，主要分布在蛻膜組織中，占蛻膜NK細(xì)胞的70%左右。研究［11］發(fā)現(xiàn)，蛻膜CD56brightCD16-NK細(xì)胞可分泌大量細(xì)胞因子，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及血管重塑，對(duì)成功妊娠發(fā)揮積極作用。本研究證實(shí)了外周血中CD56brightCD16-NK細(xì)胞對(duì)RSA患者成功妊娠的積極作用。PARK等［7］認(rèn)為外周血NK細(xì)胞能反映蛻膜NK細(xì)胞水平的變化，是預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的有效指標(biāo)，但外周血CD56brightCD16-NK細(xì)胞增多是否會(huì)促進(jìn)蛻膜CD56brightCD16-NK細(xì)胞的募集目前僅是一種猜測(cè)，需要進(jìn)一步研究。本研究中，為了更深入探討NK細(xì)胞受體與RSA的相關(guān)性，對(duì)NK細(xì)胞的活化性受體NKG2C進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RSA流產(chǎn)患者NKG2C+NK細(xì)胞比例顯著高于RSA妊娠患者與正常早孕期孕婦（P＜0.05），提示外周血中NKG2C+NK對(duì)成功妊娠是不利因素。目前國內(nèi)外關(guān)于NKG2C+NK與妊娠關(guān)系的研究較少，羅方媛等［12］研究發(fā)現(xiàn)重度子癇前期患者蛻膜NK細(xì)胞激活性受體NKG2C+NK的表達(dá)水平增加，推測(cè)其表達(dá)增高可能導(dǎo)致NK細(xì)胞殺傷能力增強(qiáng)，從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤能力，導(dǎo)致子癇前期的發(fā)病。RSA與子癇前期的發(fā)病機(jī)制相似，在RSA患者外周血中發(fā)現(xiàn)了相同的表達(dá)趨勢(shì)，需進(jìn)一步探究其具體作用機(jī)制。

表2 3組NK細(xì)胞及NKG2C+NK細(xì)胞比例比較（%）Tab.2 NK cells and NKG2C+NK cells ratios of three groups（%）

綜上所述，本研究結(jié)果提示，RSA患者外周血NK細(xì)胞百分比變化及NKG2C+NK細(xì)胞增多可能導(dǎo)致免疫平衡失調(diào)，引起自然流產(chǎn)，對(duì)于NK細(xì)胞數(shù)量較高的RSA患者可以嘗試針對(duì)性的免疫治療方案。本研究還存在一定的局限性，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行比較分析。