新生小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的分離方法

國(guó)敏，郝佳琳，朱慶鋒，李丹妮，李小曼

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，沈陽(yáng) 110122；2.附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001）

肺泡上皮細(xì)胞包括Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar typeⅡ epithelial cell，AECⅡ）的數(shù)量較肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞多，占肺泡上皮細(xì)胞的60 %，但其體積較小，僅覆蓋肺泡表面的5 %［1-2］。AECⅡ可以合成、儲(chǔ)存并分泌肺表面活性物質(zhì)（pulmonarysurfactant，PS）和相關(guān)蛋白，從而降低肺泡表面張力，增加肺的順應(yīng)性，維持大小肺泡容積的相對(duì)穩(wěn)定，防止肺不張和肺水腫。近年來(lái)，有關(guān)AECⅡ的研究［3-4］在國(guó)內(nèi)外已受到高度重視，其與許多肺部疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，PS的變異是引起新生兒急性呼吸窘迫綜合征的重要因素［5-6］。然而，目前缺乏理想的細(xì)胞模型，研究出簡(jiǎn)單、高效、高純度的方法尤為重要。本研究首次以新生24 h內(nèi)的小鼠為研究對(duì)象，提出一種分離培養(yǎng)原代AECⅡ的新方法，為今后有關(guān)肺部疾病的研究提供了較好的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

DPBS（不含 Ca2+和Mg2+）、Dispase、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；DNA酶 Ⅰ、Mouse IgG（美國(guó)Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基（中國(guó)BI公司）；免疫磁珠、Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔抗體（美國(guó)Invitrogen公司）；表面活性蛋白-A（surfactant protein A，SP-A抗體）、表面活性蛋白-B（surfactant protein B，SP-B）抗體、表面活性蛋白-C前體（prosurfactant protein C，proSP-C）抗體（美國(guó)Millipore公司）；生物素化的CD45、CD16/CD32和 Ter119抗體（美國(guó)BD公司）；纖連蛋白（中國(guó)Corning公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo scientific公司）；正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；透射電鏡（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 單細(xì)胞懸浮液的制備：將一對(duì) C57B/L6雌雄小鼠合籠21 d左右，取出生24 h內(nèi)的新生小鼠。75%乙醇擦拭新生小鼠腹部皮膚，尖頭鑷子破開幼鼠腹部，棄掉腹腔臟器，夾斷腎動(dòng)脈，暴露出心臟與肺部。將無(wú)菌胰島素注射器插入心臟右心室，注入1～2 mL DPBS，直到視覺上肺部變白。剝離幼鼠頸部組織，暴露氣管。將含有消化酶Dispase的無(wú)菌胰島素注射器插入氣管，針頭不要插入過(guò)深，避免插進(jìn)支氣管。緩慢均勻注入100～150 μL Dispase，直至整個(gè)肺部由白色變?yōu)槌溆?、半透明狀態(tài)。若只有一側(cè)肺充盈而另一側(cè)肺未變，則說(shuō)明進(jìn)針過(guò)深，進(jìn)入支氣管。肺部塌陷5 min后剝離出肺組織，盡量去除氣管、支氣管和血管組織，并將肺組織移至含有1 mL Dispase的EP管中。在室溫?fù)u床上孵育20 min后，將肺組織剪碎，使其充分與Dispase接觸，并在搖床上繼續(xù)孵育20 min。放置于4 ℃離心機(jī)，以300g離心10 min后，棄上清，留下肺組織和細(xì)胞。在EP管中加入2 mL含有DNA酶Ⅰ的DMEM培養(yǎng)基（0.01 % DNA酶Ⅰ+1 %Pen/Strep+10 %胎牛血清），混勻并放置于室溫?fù)u床上孵育10 min。將得到的細(xì)胞懸浮液依次通過(guò)100目、400目和425目細(xì)胞過(guò)濾篩網(wǎng)，每次用500 μL上述DMEM培養(yǎng)基沖洗各過(guò)濾器。通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。放置于4 ℃離心機(jī)，以300g離心10 min后，棄上清，每107細(xì)胞重懸于0.4 mL DMEM完全培養(yǎng)基（1 % Pen/Strep+10 %胎牛血清）中，數(shù)量不足的計(jì)為107。分別加入5 μL生物素化的CD45、CD16/CD32和 Ter119抗體。充分混合后，4 ℃下孵育10 min。如果肉眼可見細(xì)胞沉淀偏紅，即血細(xì)胞多，可適當(dāng)增加Ter119抗體劑量。此時(shí)應(yīng)同時(shí)清洗免疫磁珠。取新EP管，每1×107細(xì)胞加入10 μL 免疫磁珠，用500 μL DPBS沖洗，置于磁力架上5 min，棄液。重復(fù)3次。在孵育完畢的EP管中加入500 μL DMEM完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，放置于4 ℃離心機(jī)，300g離心10 min。每1×107個(gè)細(xì)胞用90 μL DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。再加入洗好的免疫磁珠，充分混合并在4 ℃下孵育15 min。加入500 μL DMEM完全培養(yǎng)基液洗滌細(xì)胞，放置于4 ℃離心機(jī)，以300g離心10 min。此時(shí)，與免疫磁珠結(jié)合和未結(jié)合的細(xì)胞均在沉淀中。棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于500 μL DMEM完全培養(yǎng)基中。

1.2.2 磁珠分離：將上述EP管置于磁場(chǎng)中，靜置10 min后磁珠均被吸附到管壁上，收集上清（含有未與免疫磁珠結(jié)合的細(xì)胞到新的EP管中，此為初步純化的AECⅡ）。每次用500 μL DMEM完全培養(yǎng)基清洗免疫磁珠，共3次。3次收集的上清置于同一管中。通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。AECⅡ培養(yǎng)：放置于4 ℃離心機(jī)，以300g離心10 min后，用DMEM完全培養(yǎng)基懸浮并鋪在IgG抗體包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。在37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，收集未附著的細(xì)胞懸浮液。放置于4 ℃離心機(jī)，以300g離心10 min。細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪在加有纖連蛋白的60 mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞活力

取接種到培養(yǎng)皿的細(xì)胞懸液和0.4 %的臺(tái)盼藍(lán)溶液各50 μL，充分混勻，靜置1～2 min。取10 μL細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。低倍鏡計(jì)數(shù)500細(xì)胞，其中細(xì)胞被染成藍(lán)色為死亡細(xì)胞，無(wú)色為活細(xì)胞。細(xì)胞存活率（%）=（總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)×100 %。

1.4 AECⅡ的鑒定

1.4.1 電鏡鑒定：取培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并用完全培養(yǎng)基終止消化后，放置于4 ℃離心機(jī)，1 500 r/min 離心10 min，棄上清，并沿著管壁緩慢加入2.5 %戊二醛，固定24 h后按照電鏡切片制作步驟進(jìn)行制備，并在電鏡下觀察細(xì)胞。

1.4.2 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)特異性肺泡表面活性蛋白的表達(dá)：將1×105細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中（預(yù)先放置玻璃片），繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)胞固定于4 %多聚甲醛中30 min，PBS洗滌3次后，用含有0.5 % TritonX-100的PBS室溫打孔15 min。PBS 洗滌3 次，在即用型山羊血清中加入0.5% TritonX-100作為封閉液，室溫封閉細(xì)胞1 h。加入proSP-C/SP-B的特異性一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。室溫下PBS洗滌3次，滴加用封閉液稀釋的1∶200的熒光二抗，避光并室溫孵育1 h，PBS 洗滌3次，細(xì)胞核DAPI染色5 min，PBS 洗滌3 次，熒光封片劑封片。正置熒光顯微鏡觀察陽(yáng)性細(xì)胞染色情況。

1.4.3 蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中特異性蛋白的表達(dá)：刮取培養(yǎng)24 h的細(xì)胞干，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，放置于4 ℃離心機(jī)，13 500 r/min離心20 min獲得蛋白液，定蛋白總量為30 μg、總體積為20 μL，制成蛋白樣品。將蛋白樣品加入上樣孔中進(jìn)行凝膠電泳，直至分離膠中看到不同分子量的蛋白明顯分開。在4 ℃冰箱中，80 V恒壓下可將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，大約2 h。用TBST配置5 %的脫脂奶粉作為封閉液，室溫封閉1 h，將proSP-C和SP-A的特異性一抗分別按照抗體說(shuō)明書用TBS稀釋，放置4 ℃搖床上孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗3次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h，用TBST洗3次，每次10 min，再應(yīng)用底物化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力檢測(cè)

經(jīng)過(guò)磁珠分選后，初步純化的AECⅡ細(xì)胞量為4×106，鋪在包被IgG的培養(yǎng)皿24 h后，純化的AECⅡ?yàn)?×105。

2.2 透射電鏡結(jié)果

透射電鏡結(jié)果顯示，AECⅡ表面可見微絨毛，細(xì)胞器豐富，尤其多見細(xì)胞特異結(jié)構(gòu)板層小體，多數(shù)呈同心圓排列，見圖1。

圖1 透射電子顯微鏡中AECⅡ的形態(tài) ×12 000Fig.1 The form of AECⅡ in transmission electron microscopy ×12 000

2.3 免疫熒光結(jié)果

免疫熒光結(jié)果顯示，肺泡表面活性蛋白在AECⅡ表達(dá)呈陽(yáng)性。proSP-C和SP-B用綠色熒光標(biāo)記，細(xì)胞核DAPI染色呈藍(lán)色，見圖2。

2.4 免疫印跡結(jié)果

以肺泡上皮細(xì)胞MLE12作為陽(yáng)性對(duì)照組，根據(jù)條帶的位置，可以觀察到分離純化后AECⅡ表達(dá)的proSP-C、SP-A蛋白呈陽(yáng)性，見圖3。

圖2 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中SP-B和proSP-C的表達(dá) ×400Fig.2 The expression of SP-B and proSP-C in AEC Ⅱ ×400

圖3 AECⅡ中免疫印跡檢測(cè)SP-A和proSP-C的表達(dá)Fig.3 The expression of SP-A and proSP-C in AEC Ⅱ detected by Western blotting

3 討論

原代AECⅡ的分離純化方法有很多，例如差速貼壁法、梯度離心法和酶處理法等［7-8］，但大多數(shù)存在處理時(shí)間較長(zhǎng)，操作繁瑣，純度不高等不足。將酶處理法和免疫磁珠分選法2種方法結(jié)合到一起，大大縮短了小鼠肺細(xì)胞體外處理的時(shí)間，并且能得到高純度的AECⅡ。首先灌注肺組織，沖出留在肺泡血管中的絕大部分血細(xì)胞，然后通過(guò)氣管直接在肺中注入Dispase，使消化酶充盈在肺泡細(xì)胞之間，高效消化細(xì)胞。利用AECⅡ較小的特點(diǎn)，使單個(gè)肺細(xì)胞依次通過(guò)不同孔徑的細(xì)胞過(guò)濾篩網(wǎng)，AECⅡ能通過(guò)小孔徑的篩網(wǎng)。接著，應(yīng)用免疫磁珠分選法，在磁場(chǎng)下將表達(dá)CD45（白細(xì)胞）、CD16/CD32（巨噬細(xì)胞）和Ter119（紅系細(xì)胞）的細(xì)胞吸附去除，上清液中的細(xì)胞即為初步純化的AECⅡ。由于IgG可與含IgG Fc受體的淋巴細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞牢固結(jié)合，所以用IgG抗體包被的培養(yǎng)皿，能進(jìn)一步清除雜細(xì)胞并純化AECⅡ［8］。最后在細(xì)胞中加入纖連蛋白，使AECⅡ黏附在培養(yǎng)皿上，以便于繼續(xù)培養(yǎng)。

通過(guò)電鏡可以清楚觀察AECⅡ的形態(tài)及其內(nèi)容物。AECⅡ表面有微絨毛，在胞質(zhì)中含有豐富的細(xì)胞器，其中特異結(jié)構(gòu)板層小體是鑒定AECⅡ的一個(gè)重要指標(biāo)。除此之外，還可以檢測(cè)AECⅡ分泌的脂蛋白PS［9-11］。聯(lián)合這兩種方法，再用小鼠肺上皮細(xì)胞設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，從而對(duì)比判斷AECⅡ。

AECⅡ是多能干細(xì)胞，可以分化成肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞［8，12］，但在體外不容易增殖。因此對(duì)于AECⅡ的培養(yǎng)時(shí)間以及如何減緩其分化有待進(jìn)一步研究。每種分離方法都避免不了細(xì)胞破壞，如何最大程度減少細(xì)胞的損傷，是接下來(lái)要改進(jìn)的方向。