胃癌相關(guān)分子分類的研究進展

高青，莊麗維

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科，哈爾濱 150001

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，國際癌癥研究機構(gòu)的報告指出，2018年全球惡性腫瘤死亡人數(shù)預(yù)計為960萬（不包括非黑色素瘤皮膚癌），其中胃癌死亡人數(shù)為78萬，即每12個因惡性腫瘤死亡的患者中就有1例死于胃癌，使其成為世界第三大癌癥死亡原因，以及第五位最常被診斷的癌癥[1]。無論是新發(fā)病例還是死亡病例，男性均是女性的兩倍。盡管目前中國胃癌的發(fā)病率仍然遠高于英國和美國，較之前卻有所下降。據(jù)統(tǒng)計，2000—2011年，胃癌在中國的發(fā)病率每年下降1.8%～5.5%[2]，但病死率下降不明顯，5年總生存率很低，2013—2015年胃癌患者5年生存率＜35%[3]。2018年，中國消化道癌占中國癌癥總死亡人數(shù)的36.4%，而在美國及英國該比例不超過5%；胃癌死亡人數(shù)在消化道癌中占37.4%，是中國消化道癌的主要死亡原因[4]。這些可能與中國較低的早期癌癥檢出率及不同地區(qū)提供的不夠標準的治療策略有關(guān)。胃癌的危險因素主要有幽門螺桿菌、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染、遺傳、環(huán)境、飲食及生活習(xí)慣等。對胃癌分子特性的研究不僅可以幫助提高早期診斷率，明確治療策略，還有助于對發(fā)病機制的研究。本文通過對胃癌不同分子分類亞型的特性及其在臨床中的研究進行綜述，為胃癌的早期診斷及精準治療提供思考和借鑒。

1 胃癌的不同分子分類體系

在全基因組特征研究之前，Ottini等[5]提出了自己的分類，隨后Tan等[6]和Lei等[7]基于基因的特征在經(jīng)過一系列的研究之后提出了新的分子分類。隨著分子基因技術(shù)的發(fā)展，研究者們對胃癌分子特性的研究更加深入，癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、亞洲癌癥研究組織（Asian Cancer Research Group，ACRG）等分子分類體系被進一步提出。

1.1 TCGA 的分子分類體系

2014年，TCGA研究網(wǎng)絡(luò)基于6個分子平臺對295例胃腺癌進行了鑒定：通過體細胞拷貝數(shù)分析、全外顯子組測序、DNA甲基化譜、信使RNA測序、微小RNA測序和反相蛋白陣列技術(shù)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測和全基因組測序，最后將胃癌綜合鑒定為4種分子亞型，分別為EBV陽性、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite unstable，MSI）、基因組穩(wěn)定（genomically stable，GS）和染色體不穩(wěn)定（chromosomally unstable，CIN）。在該項研究隊列中，不同亞型發(fā)病率依次為EBV（9%）、GS（20%）、MSI（22%）、CIN（50%）[8]。

EBV相關(guān)胃癌在全球每年發(fā)生75 000～90 000例，發(fā)病率為1.3%～30.9%，全球平均發(fā)病率為10%，為EBV腫瘤中占比最大的亞群[9-10]。EBV多見于男性（81%），MSI中女性（56%）略占優(yōu)勢。不同國家之間各亞型的患病率具有顯著差異：MSI、EBV和GS亞型之間的差異超過5倍[8]。對以上亞型在各國發(fā)病率的高度差異的研究可以確定特定分子亞型背后的分子和環(huán)境因素對胃癌發(fā)病的影響[11]。EBV多位于胃底或胃體，食管胃交界腺癌中CIN的發(fā)生率較高，MSI一般為腸型胃癌，彌漫型胃癌在GS中富集。

EBV的分子特性表現(xiàn)為廣泛的DNA啟動子的高甲基化，磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α亞型（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform，PIK3CA）的反復(fù)突變，酪氨酸受體激酶JAK2、程序性死亡受體配體 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）和程序性死亡受體配體2（programmed cell death 1 ligand 2，PDCD1LG2，也稱PD-L2）的擴增，超過50%的EBV陽性腫瘤中存在富含AT的交互式領(lǐng)域蛋白1A基因（AT-rich inter-active domain-containing protein 1A，ARID1A）突變，很少有腫瘤蛋白p53基因的突變。MSI表現(xiàn)為高突變負擔(dān)，如DNA非整倍性、染色體的結(jié)構(gòu)變化（如易位）以及各種原癌基因、腫瘤抑制基因的突變和高甲基化，尤其是作為錯配修復(fù)缺陷最常見原因的DNA錯配修復(fù)蛋白mutL同源物1（mutL homolog 1，MLH1）基因的啟動子高甲基化[8,12]。通常使用5個微衛(wèi)星標記確定MSI微衛(wèi)星序列長度變化的累積[13]，根據(jù)不穩(wěn)定標記的數(shù)量，將MSI分為高MSI（MSI-H）（≥2/5不穩(wěn)定標記）和低MSI（MSI-L）（1/5不穩(wěn)定標記）。沒有不穩(wěn)定標記的腫瘤被認為是微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）的。在7%～24%的胃癌中可檢測到MSI-H與DNA錯配修復(fù)缺陷有關(guān)[14-15]。MSI-L表型在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)，但其生物學(xué)和臨床意義尚不明確，MSI-L和MSS腫瘤常被合并為一組[16-17]。GS亞型通常顯示負責(zé)細胞黏附的基因發(fā)生突變，如Ras同系物家族成員A基因（Ras homolog family member A，RHOA）、1型鈣黏蛋白基因（cadherin 1，CDH1）和緊密連接蛋白18-Rho GTPase激活蛋白融合基因（claudin 18-rho GTPase activating protein，CLDN18-ARHGAP）。CIN表現(xiàn)為非整倍性和受體酪氨酸激酶的局灶性擴增，并在TP53突變中富集。研究者發(fā)現(xiàn)CIN亞型患者輔助化療獲益最大，GS亞型患者獲益最少[18]。盡管MSI對氟尿嘧啶無反應(yīng)，輔助化療對該亞型患者缺乏明顯益處，但較低的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率使其能代表良好的預(yù)后[19-23]。雖然EBV陽性與胃癌患者的生存預(yù)測無明顯相關(guān)性[15,24]，但其對術(shù)后輔助化療的獲益具有一定提示作用：一項包含了760例胃或胃食管交界處（gastroesophageal junction，GEJ）腺癌患者的研究通過分析基于鉑/5-氟尿嘧啶的術(shù)前化療下EBV和MSI對胃癌和胃食管交界癌的診斷和預(yù)后預(yù)測意義，發(fā)現(xiàn)盡管MSI-H和EBV陽性不能預(yù)測鉑/5-氟尿嘧啶的術(shù)前化療的療效，卻可以提示良好的預(yù)后，而且MSI-H在不同的治療方法中都可以代表良好的預(yù)后[25]。MSI-L可以提示單純手術(shù)治療患者的不良預(yù)后和術(shù)前對化療的良好反應(yīng)，因此MSI-L能幫助識別在術(shù)前接受鉑/5-氟尿嘧啶治療中獲益的患者。西方國家對進展期胃癌患者采用含鉑/5-氟尿嘧啶聯(lián)合化療的術(shù)前圍手術(shù)期化療，但療效有限[26-27]，或許研究者們應(yīng)該在了解不同個體的分子特性的基礎(chǔ)上制定最佳治療計劃。相較而言，CIN和MSI亞型的總體生存率高于GS亞型，但低于EBV亞型[24,28-29]。TCGA分型提高了對發(fā)病機制及分子驅(qū)動的認識，學(xué)者們對各亞型后續(xù)的研究為該分類體系補充了預(yù)后信息。

1.2 ACRG 的分子分類體系

2015年，ACRG通過收集一家韓國轉(zhuǎn)診醫(yī)院的患者，應(yīng)用基因表達數(shù)據(jù)將胃癌分為四種亞型：MSI、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、MSS/TP53陽性（MSS/TP53+）和MSS/TP53陰性（MSS/TP53-）[30]。MSS/TP53+亞型與EBV感染有關(guān)。MSI組以MLH1缺失，多個致癌基因發(fā)生突變?yōu)樘卣?。MSS和EMT具有表達EMT相關(guān)基因以及CDH1缺失的特征。通過對EMT亞型突變基因的研究發(fā)現(xiàn)EMT中的彌漫型患者的CDH1突變與生存期縮短有關(guān)，與疾病分期無關(guān)[31]。由于TP53是胃癌中最常見的突變基因，基于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）基因和MDM2原癌基因（MDM2 proto-oncogene，MDM2）的TP53活性信號在TP53完整的腫瘤中得分較高，而在TP53功能喪失的腫瘤中得分較低。可以將MSI和EMT以外的腫瘤分為MSS/TP53+和MSS/TP53-亞型。在MSS/TP53-樣本的隊列中，TP53突變發(fā)生率最高，ARID1A、PIK3CA、WNT信號通路的APC調(diào)節(jié)器基因（APC regulator of WNT signaling pathway，APC）、鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS proto-oncogene，KRAS）、SMAD家族成員4（SMAD family member 4，SMAD4）等基因的突變也較常見，且樣本的非整倍性更高，癌基因如酪氨酸激酶2型受體基因（Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）的擴增更多。對EMT亞型的輔助化療或檢查點阻斷并沒有明顯的獲益，可能是由于MSS/EMT患者診斷時多為晚期。在生存分析中，EMT患者預(yù)后最差，其次為TP53-腫瘤、TP53+腫瘤，最后為MSI腫瘤[30]。未來進展期胃癌的靶向治療和免疫治療的臨床試驗或許可以根據(jù)基因組或免疫學(xué)特征的差異進行設(shè)計，因為它們可能影響治療反應(yīng)和臨床結(jié)果。ACRG描述的分型與明顯的基因組改變、生存結(jié)局和術(shù)后復(fù)發(fā)模式相關(guān)。

1.3 通過新一代基因測序技術(shù)提出的分類體系

Li等[32]在對544例胃癌患者基因測序研究后提出了一種新的基于突變負擔(dān)和突變模式的胃癌分類，他們發(fā)現(xiàn)不同分子亞型胃癌發(fā)病機制存在普遍而特異的突變過程，突變負擔(dān)也不同，高突變胃癌表現(xiàn)出明顯的MSI性，通過對8個顯著突變基因：TP53、ARID1A、CDH1、PIK3CA、RHOA、APC、ERBB2和含2個新肌動蛋白結(jié)合重復(fù)序列基因（xin actin binding repeat containing 2，XIRP2）的區(qū)分得到C1和C2兩組，系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)，C1組中TP53基因突變較多，C2組中ARID1A基因突變的比例較高。C2組還具有更多定位于胃體及彌漫型胃癌的特征。與TCGA分子亞型比較后發(fā)現(xiàn)C1組中CIN亞型更豐富，C2組中GS亞型和CIN亞型分布均勻。由于C1組與更好的預(yù)后結(jié)果相關(guān)，因此C1、C2亞型也可作為胃癌的預(yù)后因子。Li等[32]提出的分類代表了未來分子分類的一種方向，C1、C2亞型對胃癌治療及預(yù)后的價值還需要進一步的探索。

1.4 GEJ腫瘤的分子分類體系

GEJ腫瘤分為食管癌和胃癌，這兩種類型癌癥在GEJ的區(qū)分比較困難。GEJ腫瘤的發(fā)病率在過去的50年里迅速增長，因此對該部位腫瘤進行明確的分類越來越重要。第8版美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）/國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）癌癥分期手冊對GEJ腫瘤分期標準的選擇做出了如下定義：若腫瘤侵及胃食管交界線且腫瘤中心位于胃食管交界線以下不超過2 cm的范圍，采用食管癌分期標準，若累及胃食管交界線但腫瘤中心位于胃食管交界線以下2 cm以外，以及未累及胃食管交界線的腫瘤，采用胃癌分期方法[33]，這也代表了GEJ腫瘤的解剖分類。這種分類方法雖然考慮了腫瘤的位置以指導(dǎo)最佳手術(shù)方式，卻忽略了腫瘤的生物學(xué)特性。Bornschein等[34]用Illumina-HTv4.0芯片檢測107例初治腸型胃食管腺癌患者的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)了3種不同的分子亞型，它們與解剖位置、腫瘤分期或分級無關(guān)，只與表達的關(guān)鍵通路有關(guān)：第一種亞型上調(diào)了可以增加黏膜抵抗反流能力的胃特異性基因的表達；第二種亞型表達活躍在腸道和膽道相關(guān)代謝途徑的腸道特異性基因；第三種亞型的活性基因與炎癥調(diào)控相關(guān)。以上3種亞型在生物通路表達中的區(qū)別意味著這些差異可以為GEJ腫瘤的治療提供參考。對于解剖分類存在爭議的腫瘤，根據(jù)生物特性進行分類或許是一個可以考慮的選擇。

2 TCGA、ACRG 分子分類研究進展

Li等[32]和Bornschein等[34]提出的分子分類有待進一步研究，TCGA和ACRG分子分類的臨床價值已經(jīng)被認可，學(xué)者們將TCGA、ACRG分類與臨床常用的Lauren組織病理學(xué)分類聯(lián)系起來，從不同的角度探索分子亞型的臨床實踐。

2.1 TCGA、ACRG及Lauren分類的區(qū)別與聯(lián)系

通過對TCGA及ACRG分類中分子亞型的組織病理學(xué)及基因特征的歸納，發(fā)現(xiàn)雖然TCGA中的GS亞型和ACRG中的EMT亞型均以彌漫型為主（分別為75%和80%），但是，一方面這兩種分類體系中的其他亞型的彌漫型分布有所不同：ACRG中非EMT亞型彌漫型腫瘤的發(fā)生率為30%～46%，而TCGA中非GS亞型彌漫型腫瘤的發(fā)生率則小于25%[8,30]；另一方面，CDH1突變在TCGA的GS亞型中非常普遍（37%），但在ACRG的EMT亞型中并不常見（2.8%），TCGA的GS亞型特有的RHOA突變在ACRG的EMT亞型中也很罕見，而該突變在其他ACRG亞型中較EMT亞型更為常見。以上表明TCGA中的GS亞型和ACRG中的EMT亞型存在較大的差異。世界衛(wèi)生組織（WHO）分型中的差黏附性的腫瘤（包括部分或全部由印戒細胞構(gòu)成的腫瘤）對應(yīng)Lauren彌漫型類型，最近的一項研究描述了與其他類型的差黏附性腫瘤相比，印戒細胞為主的腫瘤中缺乏RHOA突變[35]。這從側(cè)面說明彌漫型胃癌與GS或EMT亞型沒有確切的對應(yīng)關(guān)系。盡管TCGA中的CIN亞型和ACRG中的MSS/TP53-亞型具有高度相似的結(jié)構(gòu)基因組改變，二者的基因擴增都比較多，但是CIN亞型的基因擴增明顯多于MSS/TP53-亞型。TCGA的CIN亞型多發(fā)生在胃近端，其發(fā)病率隨著近年來西方人群近端胃癌的發(fā)生率的上升而升高，而ACRG研究中近端胃癌發(fā)病率在降低，且Lauren彌漫型的比例比TCGA研究中較高。因此TCGA、ACRG與Lauren組織病理學(xué)分類是三種獨立存在的分類體系。

Birkman等[36]使用免疫組化和原位雜交技術(shù)對244例胃腺癌的分子特性進行了歸納分析，在該隊列中：多見于男性的EBV陽性腸型腫瘤大多定位于胃體，大多數(shù)TP53異常的腸型腫瘤位于近端；所有MSI腫瘤均為腸型，且與總體生存率提高有關(guān)。幾個受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），如ERBB2、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）和成纖維細胞生長因子2型受體（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2），已報告在胃癌中擴增[37]。2014年TCGA在所有EGFR或ERBB2基因擴增的腫瘤中均觀察到腸型胃癌[8]。此次研究進一步證實RTK擴增在腸型腫瘤中更為普遍，所以在研究靶向治療胃癌的RTK時，組織學(xué)亞型可能是一個需要考慮的相關(guān)因素。綜上所述，在未來的臨床試驗中，為了提高新的靶向治療所獲得的臨床效益，可能需要將組織學(xué)和分子分類方法協(xié)同應(yīng)用，以更好地指導(dǎo)臨床試驗。

2.2 分子分類在臨床實踐中的應(yīng)用研究

在TCGA的MSI和EBV亞型中，偶發(fā)性MSI胃癌的超突變特性和EBV陽性胃癌中常見的PD-L1擴增使患者易于發(fā)生免疫檢查點阻斷[16,38-39]。MSI和EBV陽性的腫瘤對抗程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）的治療具有顯著反應(yīng)，總體反應(yīng)率分別為85%和100%[23]。因此MSI和EBV可以預(yù)測胃癌患者對免疫檢查點阻斷劑的反應(yīng)，是有用的生物標志物[40]。AJCC建議胃癌和結(jié)直腸癌患者進行MSI檢測[33]。盡管新一代測序技術(shù)可能是檢測MSI最敏感的方法，但是在臨床中錯配修復(fù)蛋白的免疫組化檢測被認為是最經(jīng)濟有效的方法，且聚合酶鏈反應(yīng)的結(jié)果與免疫組化的結(jié)果有很好的一致性。由此可見，基于潛在的治療及預(yù)后意義，在常規(guī)臨床實踐中將EBV的原位雜交和MSI的免疫組化檢測結(jié)果納入病理報告可能是有益的[40]。

3 小結(jié)與展望

從組織學(xué)和分子角度看，胃癌是一種異質(zhì)性疾病。目前組織病理學(xué)仍廣泛應(yīng)用于臨床，隨著新出現(xiàn)的系統(tǒng)治療方案和多模式治療概念在治療方法中越來越占優(yōu)勢，了解定義不同腫瘤亞型的生物學(xué)特性變得越來越重要。分子分類研究的發(fā)展讓學(xué)者們開始意識到在評估組織病理學(xué)的同時評估胃癌的分子特性，使其共同指導(dǎo)臨床決策的重要性。目前對TCGA、ACRG各分子亞型及臨床特性已經(jīng)有了初步的了解，新的分子亞型還在等待進一步研究。隨著新一代基因測序技術(shù)的加入，未來的認識會更加深入。這些認識除了會進一步改善分子分類體系以外，還能幫助發(fā)現(xiàn)不同分子亞型特異的標志物，在精準治療上更進一步。目前分子分類在臨床中適用仍存在困難，除了需要進一步證明各分子亞型的臨床意義以外，也需要考慮其較高的成本。因此，在確定某種分子亞型臨床價值的基礎(chǔ)上找到經(jīng)濟可行的普及方法也是將來需要面對的挑戰(zhàn)。