胃癌過繼性T 淋巴細(xì)胞免疫治療的研究進(jìn)展

彭黎明，楊林

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，北京 100021

胃癌作為常見的消化道腫瘤之一，患者往往確診時已處于晚期，經(jīng)過傳統(tǒng)手術(shù)、化療、放療，其5年生存率仍不到20%[1]。近年來，腫瘤免疫治療取得突破性進(jìn)展，主要?dú)w功于免疫檢查點(diǎn)抑制劑和嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）的顯著臨床療效。免疫治療不僅對其他治療耐藥的腫瘤產(chǎn)生療效，而且能使傳統(tǒng)治療認(rèn)為不可能治愈的播散性腫瘤獲得長期臨床緩解[2]。然而，仍有相當(dāng)一部分患者對免疫治療無反應(yīng)，如抗程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）單抗單藥三線治療晚期胃癌的客觀緩解率（objective response rate，ORR）為11%～12%，患者中位總生存期（overall survival，OS）為5.3～5.5個月[3-4]；單藥二線治療晚期胃癌的ORR為16%，患者中位OS為9.1個月，與標(biāo)準(zhǔn)的單藥紫杉醇化療（中位OS為8.3個月）相比，并無明顯優(yōu)勢[4]。盡管單藥聯(lián)合化療一線治療晚期胃癌的ORR為60%，明顯高于單純化療的25%～48%[5-6]，但并未轉(zhuǎn)化為OS延長（12個月vs8.0～11.2個月）[6-7]。有效的免疫治療依賴于免疫細(xì)胞（尤其是T淋巴細(xì)胞）摧毀腫瘤細(xì)胞的能力。免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效微弱的原因可能與這些患者腫瘤組織周圍浸潤的淋巴細(xì)胞數(shù)量太少或活性太低有關(guān)[8]。過繼性細(xì)胞免疫治療（adoptive cell therapy，ACT）是將患者自體的免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞或T細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后回輸至患者體內(nèi)，從而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。國外最早于1985年就開始應(yīng)用ACT治療惡性黑色素瘤[9]，直到2017年，兩種CAR-T細(xì)胞被批準(zhǔn)用于治療兒童和成人B細(xì)胞腫瘤，成為腫瘤過繼免疫治療的里程碑事件。目前，常用的過繼性T淋巴細(xì)胞免疫療法主要包括回輸細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（cytokine induced killer，CIK）細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）、CAR-T及T細(xì)胞受體改造的T細(xì)胞（T cell receptor engineered T cell，TCR-T）。

1 ACT 細(xì)胞種類及在胃癌中的研究進(jìn)展

1.1 CIK

CIK細(xì)胞是將人外周血單個核細(xì)胞在體外由多種細(xì)胞因子共培育而獲得的一群異質(zhì)性細(xì)胞，其中，CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞，既具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的殺瘤活性，又具有NK細(xì)胞非主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex class，MHC）限制性殺瘤的特點(diǎn)，因此，其又被稱為NK樣T淋巴細(xì)胞[10]。關(guān)于CIK細(xì)胞的臨床研究已在肝癌、肺癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中開展[11-16]。DC是迄今為止已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），能有效刺激T細(xì)胞對異型抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。將DC與CIK于體外共同培養(yǎng)，既可促進(jìn)DC的成熟，又可增強(qiáng)CIK細(xì)胞的殺瘤活性。共培養(yǎng)后的DC表面標(biāo)志物CD40、CD80、CD86的表達(dá)比單純DC培養(yǎng)時增加了1.2倍，CIK細(xì)胞的活性亦明顯提高[17]。DC-CIK細(xì)胞能夠在體外快速增殖，且抗瘤譜廣，安全性好，因而得到廣泛應(yīng)用[18]。一項對比化療聯(lián)合DC-CIK與單純化療一線治療晚期胃癌臨床療效的初步研究發(fā)現(xiàn)，化療聯(lián)合DCCIK治療具有延長患者OS、無進(jìn)展生存期（prog-ress free survival，PFS）及提高患者ORR的趨勢，且安全性高；與單純化療相比，DC-CIK治療后的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+細(xì)胞數(shù)目及百分比均明顯升高，差異顯著[19]。一項前瞻性非隨機(jī)對照研究發(fā)現(xiàn)，4組晚期胃癌患者分別接受替吉奧（S-1）單藥、S-1+順鉑（SP）、DCCIK+S-1、DC-CIK+SP治療，其疾病控制率（disease control rate，DCR）分別為 5.6%、33.3%、47.1%和76.9%，化療聯(lián)合DC-CIK組患者的PFS、OS情況均明顯優(yōu)于單純化療組；DC-CIK治療后，63.3%的患者的外周血ctDNA突變數(shù)量及頻率下降[20]，提示細(xì)胞毒性藥物攻擊腫瘤細(xì)胞后可引起腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變[20]，進(jìn)而使腫瘤抗原釋放增加從而提供更多新的抗原表位，促進(jìn)DC對抗原的呈遞，這種相互作用可使腫瘤血管正?；痆21]，從而使細(xì)胞毒性T細(xì)胞能夠進(jìn)入腫瘤組織。一項Ⅰ期臨床研究采用于體外經(jīng)派姆單抗（pembrolizumab）處理的DC-CIK治療既往治療失敗的晚期實(shí)體瘤，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗腫瘤活性，γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的分泌明顯增加；31例患者中，7例患者達(dá)到部分緩解（partial response，PR），其中，6例患者緩解持續(xù)超過5個月，DCR為64.5%；20例患者發(fā)生治療相關(guān)不良事件（adverse event，AE），2例患者發(fā)生3/4級AE（包括發(fā)熱、寒戰(zhàn)），所有治療相關(guān)AE均是可逆和可控的[22]。CIK細(xì)胞與靶向藥物及其他治療在胃癌中的聯(lián)合應(yīng)用仍在探索中。

1.2 TIL

TIL是在腫瘤及其周圍組織聚集的一群具有異質(zhì)性的免疫細(xì)胞，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等。過繼TIL療法是將腫瘤組織周圍具有腫瘤特異性的T細(xì)胞從免疫抑制的腫瘤微環(huán)境中分離后在體外擴(kuò)增、加工，使T細(xì)胞數(shù)量增多、抗腫瘤活性增強(qiáng)，再回輸至患者體內(nèi)從而發(fā)揮特異性抗腫瘤作用。目前的研究方向是提高回輸效應(yīng)細(xì)胞的質(zhì)量以及簡化獲得腫瘤特異性T細(xì)胞的方法。研究發(fā)現(xiàn)，輸注TIL后腫瘤發(fā)生退縮是由靶向腫瘤特異性抗原（也稱新抗原）的T細(xì)胞（即新抗原反應(yīng)性T細(xì)胞）介導(dǎo)的[23]。同樣，免疫檢查點(diǎn)抑制劑發(fā)揮療效也可能是通過這些新抗原反應(yīng)性T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的[24-25]。富集這些新抗原反應(yīng)性T細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增和回輸可能增加療效。獲得TIL需要進(jìn)行腫瘤組織活檢，這就限制了TIL的應(yīng)用。PD-1和4-1BB可被用作新抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的標(biāo)記物[26-27]，通過檢測外周血淋巴細(xì)胞中PD-1的表達(dá)可以識別惡性黑色素瘤患者外周血中的新抗原反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞[28]，這就為采用非侵襲性方法進(jìn)行T細(xì)胞為基礎(chǔ)的個體化治療提供了新的策略。此外，靶向新抗原的個體化疫苗可激活之前已存在的以及全新的新抗原特異性T細(xì)胞免疫[29]。這些經(jīng)過腫瘤疫苗或免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療后產(chǎn)生的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的抗原特異性更強(qiáng)，有望進(jìn)一步提高TIL治療的臨床療效。上述研究多僅限于實(shí)驗(yàn)室階段，一項在Clinical Trial注冊的、評估TIL治療實(shí)體瘤有效性和安全性的2期臨床試驗(yàn)（NCT03935893）目前正處于患者招募階段。

1.3 CAR-T

CAR-T療法是利用基因工程技術(shù)將識別某種抗原分子的抗體可變區(qū)（scFv）基因序列與TCR的胞內(nèi)區(qū)序列拼接后，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒、質(zhì)粒等載體轉(zhuǎn)染至T淋巴細(xì)胞內(nèi)，并表達(dá)融合蛋白[即嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）]于T細(xì)胞表面，再通過非MHC限制性的方式識別特定抗原，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[30]。CAR-T至今已發(fā)展至第5代[31]，第一代CAR-T對腎癌[32]、卵巢癌[33]等實(shí)體瘤的療效均不理想。關(guān)于第二、三代CAR-T對實(shí)體瘤的療效也少有成功的報道，Morgan等[34]報道1例使用第三代CAR-T技術(shù)治療1例結(jié)腸癌合并肝肺轉(zhuǎn)移患者出現(xiàn)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”而導(dǎo)致死亡的嚴(yán)重不良事件。第四代CAR-T[35]使CAR作為一種載體表達(dá)CK，但是，對于CK的毒性，無法很好地預(yù)測和處理。第五代CAR-T在第四代CAR-T的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)后，使T淋巴細(xì)胞僅在激活時釋放CK，相對減少了CK的相關(guān)毒性。CAR-T療法對非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病及多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)腫瘤有良好療效[36]。目前，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的兩款CAR-T產(chǎn)品均通過靶向B細(xì)胞表面CD19抗原用于治療B細(xì)胞白血病，但CAR-T在實(shí)體瘤中的應(yīng)用相對較少。目前，研究發(fā)現(xiàn)其主要原因包括以下3點(diǎn)：①CAR-T細(xì)胞進(jìn)入實(shí)體瘤時需要克服缺氧、低PH值及營養(yǎng)供應(yīng)缺乏的微環(huán)境[37]，此種腫瘤微環(huán)境會抑制CAR-T細(xì)胞的長期存活并發(fā)揮作用。②實(shí)體瘤的抗原特異性遠(yuǎn)高于血液系統(tǒng)腫瘤，在實(shí)體瘤中很難找到一個表達(dá)于所有腫瘤細(xì)胞的抗原靶點(diǎn)[38]，這也是目前CAR-T在實(shí)體瘤中應(yīng)用的最大困難。③CAR-T細(xì)胞進(jìn)入實(shí)體瘤需要趨化因子輔助，然而，研究表明，實(shí)體瘤微環(huán)境中的趨化因子與CAR-T不匹配[39]。雖然CAR-T在實(shí)體瘤中幾乎未應(yīng)用，但已有的動物實(shí)驗(yàn)和臨床Ⅰ期試驗(yàn)結(jié)果顯示，CAR-T細(xì)胞療法治療癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）陽性的消化道實(shí)體瘤患者具有較高的安全性，經(jīng)多次輸注CAR-T細(xì)胞后，部分患者的腫瘤明顯縮小，大部分患者血清CEA的濃度明顯降低[40-41]。另外，靶向CEA的CART聯(lián)合IL-2[42]、靶向間皮素（mesothelin，MSLN）及其亞型的CAR-T[43-44]、靶向NKG2D[45]的CAR-T均在胃癌動物模型中具有明顯的抗腫瘤活性。一些新的CAR-T相關(guān)試驗(yàn)及探索如雙特異性T細(xì)胞銜接子基因編輯的T細(xì)胞技術(shù)（bispecific T cell engager T cell，BiTE-T）[46]、重新設(shè)計CAR-T成雙靶點(diǎn)[47]、串聯(lián)[48]及通用CAR-T[49]均在研究之中。但是，尚無已完成的胃癌相關(guān)CRA-T臨床試驗(yàn)，目前已注冊的與胃癌相關(guān)的CRA-T臨床試驗(yàn)共10項（NCT02744287、NCT03960060、 NCT02713984、 NCT03941626、NCT03941626、 NCT02349724、 NCT02617134、NCT03563326、NCT03890198、NCT02725125），大部分試驗(yàn)仍處于受試者招募階段。

1.4 TCR-T

隨著基因工程的進(jìn)步，針對過繼細(xì)胞治療靶向性不足的問題，研究人員對T淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞受體（T-cell receptor，TCR）基因進(jìn)行修飾或使其表達(dá)人工設(shè)計的抗原受體，從而提高T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性識別和結(jié)合能力。早先的方法是使T細(xì)胞表達(dá)的TCR能靶向腫瘤中呈高表達(dá)但在正常組織中也能表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原，如MART-1、gp100、MAGE-A3和CEA等，其療效和安全性均較差。研究發(fā)現(xiàn)，靶向紐約食管鱗狀上皮癌抗原1（New York-esophageal squamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1）的高親和力的TCR-T療法在轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)的黑色素瘤、滑膜肉瘤或骨髓瘤中的反應(yīng)率分別為55%、61%，且無嚴(yán)重不良反應(yīng)，有可能成為第一個被批準(zhǔn)用于臨床的轉(zhuǎn)基因TCR-T產(chǎn)品[50-51]。研究發(fā)現(xiàn)，新抗原反應(yīng)性T細(xì)胞才是主要的效應(yīng)細(xì)胞，因此，TCR研究的方向集中到了針對新抗原而非自身抗原[23]。靶向新抗原的TCR-T有更高的選擇性和親和力，有可能增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)，且不良反應(yīng)更少。然而，TCR-T和TIL的殺瘤效應(yīng)是MHC限制性的，MHC分子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)通常被下調(diào)，因此，限制了其發(fā)揮療效。目前，在Clinical Trial注冊的實(shí)體瘤TCR-T臨床試驗(yàn)共有25項，其中，與胃癌有關(guān)的5項研究均處于招募階段（NCT03941626、NCT03139370、 NCT03686124、 NCT02650986、NCT03190941）。

2 ACT 治療胃癌存在的問題及可能的解決措施

相比于血液系統(tǒng)腫瘤，ACT療法在胃癌及其他實(shí)體瘤中面對的障礙更多、更復(fù)雜。首先，輸注的T細(xì)胞必須能到達(dá)并浸潤至腫瘤組織中。到達(dá)腫瘤組織后，T細(xì)胞還面對著一個免疫抑制的環(huán)境，其中包括免疫抑制細(xì)胞（如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞等）、乏氧、壞死、營養(yǎng)缺乏以及一系列免疫抑制分子[如程序性死亡受體配體 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）][52-53]。此外，腫瘤患者的腫瘤環(huán)境或引流淋巴結(jié)中具有免疫調(diào)節(jié)活性的多種酶如精氨酸酶1、誘生型一氧化氮合酶、吲哚胺2,3雙加氧酶（indoleamine 2,3 dioxygenase，IDO）等的表達(dá)發(fā)生上調(diào)，這些均會導(dǎo)致T細(xì)胞活化不足和（或）T細(xì)胞抑制，使腫瘤特異T細(xì)胞效應(yīng)在循環(huán)中和腫瘤組織中不能持久，從而限制ACT的療效。此外，若腫瘤持續(xù)存在，持續(xù)的抗原暴露可導(dǎo)致內(nèi)源性T細(xì)胞耗竭。最后，即使T細(xì)胞能在免疫抑制的腫瘤環(huán)境中存活并維持其效應(yīng)功能，腫瘤抗原或抗原呈遞途徑中的成分丟失可導(dǎo)致抗原陰性的腫瘤大量生長從而發(fā)生免疫逃逸?？朔鲜稣系K的策略：①優(yōu)化過繼性T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，增加T細(xì)胞在腫瘤組織中的穿透性，提高T細(xì)胞在腫瘤或血液循環(huán)中的擴(kuò)增能力，并增加其持久性[54]，或富集具有干細(xì)胞特征的T細(xì)胞，縮短體外擴(kuò)增時間，并與細(xì)胞因子或抗原共同培養(yǎng)，延遲T細(xì)胞分化，增加持久性[55]。②由于輸注的腫瘤特異性T細(xì)胞會上調(diào)共抑制受體如PD-1、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunolobulin and mucin-containing protein-3，TIM-3）、淋巴細(xì)胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）和CD200的表達(dá)，而腫瘤細(xì)胞可通過T細(xì)胞活化介導(dǎo)的輔助性T細(xì)胞1（helper T cell 1，Th1）細(xì)胞因子的釋放產(chǎn)生共抑制配體，如PD-L1。CAR-T療法和免疫檢查點(diǎn)抑制劑（多為PD-1/PD-L1）聯(lián)合治療可能是一種避免免疫抑制的方法[56]。通過基因編輯技術(shù)[57-58]去除T細(xì)胞上PD-1基因的相關(guān)臨床研究正在進(jìn)行（NCT03399448）。靶向纖維母細(xì)胞活化蛋白（幾乎表達(dá)于所有實(shí)體瘤細(xì)胞）的CAR-T亦正在進(jìn)行臨床研究[59]。③對T細(xì)胞進(jìn)行修飾使其能產(chǎn)生白細(xì)胞介素-15（interleukin-15，IL-15）等細(xì)胞因子，表達(dá)CD40L等共刺激配體，或分泌阻斷檢測點(diǎn)的單鏈可變區(qū)片段（single-chain variable fragment，scFv）等。這些新的基因工程T細(xì)胞被稱為通用細(xì)胞因子介導(dǎo)殺傷的重定向T細(xì)胞（T cell redirected for universal cytokine-mediated killing，TRUCK）或“武裝的”T細(xì)胞，可以保留T細(xì)胞強(qiáng)大的殺瘤活性，并提高持久性。④針對新抗原的特異性T細(xì)胞能夠減少毒性，增加療效[60]。然而，實(shí)體瘤的CAR-T多靶向腫瘤相關(guān)抗原，可設(shè)計具有適當(dāng)親和力的CAR變異體，能根據(jù)靶抗原表達(dá)水平的不同區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞[61]。低親和力的CAR可對高表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒效應(yīng)，而對低表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的正常細(xì)胞，其毒性輕微或無毒性[62-63]。采用基因編輯技術(shù)破壞細(xì)胞表面TCR[防止移植物抗宿主排斥反應(yīng)（graft ver-sus host reaction，GVHR）]和β2微球蛋白（beta 2 microglobulin，β2M）或HLA-I分子（防止移植排斥反應(yīng)）的表達(dá)[57,64-65]，可實(shí)現(xiàn)同種異體T細(xì)胞的輸注，用于淋巴細(xì)胞缺乏或身體狀況差的患者。

3 小結(jié)與展望

近年來，ACT尤其是TCR-T、CAR-T治療腫瘤的研究進(jìn)展很快，在某些腫瘤中已顯示出很好的療效，但對實(shí)體瘤的療效仍有限。如何增加效應(yīng)T細(xì)胞的功能、優(yōu)化T細(xì)胞的生產(chǎn)、減少臨床毒性與T細(xì)胞耗竭及避免腫瘤微環(huán)境的免疫抑制以達(dá)到臨床應(yīng)用是ACT研究需要迫切解決的問題。免疫治療是目前腫瘤治療的手段之一，將來有可能成為腫瘤治療的基本手段。未來的方向可能是根據(jù)胃癌腫瘤微環(huán)境中不同的免疫狀態(tài)給予不同的免疫治療策略，例如：對于腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）高的患者，可考慮選擇免疫檢查點(diǎn)抑制劑和TIL[24]；對于TMB低的患者，可考慮高親和力的TCR-T；若有合適的腫瘤表面標(biāo)記，則可考慮CAR-T。在免疫治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他治療手段如化療、靶向治療、放療等有望成為將來腫瘤治療的最佳策略。