生長分化因子在椎間盤退行性病變中的研究進(jìn)展

楊榮，趙剛

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷外科，云南 昆明)

0 引言

腰痛是椎間盤退變患者最常見的就診原因，也是影響生活和工作的重要因素[1]。盡管導(dǎo)致腰痛的原因復(fù)雜繁多，但椎間盤(IVD)退變早已被證實(shí)為主要病因[2，3，4]。IVD 是位于椎體間的纖維軟骨組織，約占脊柱總長度的1/3[5]。椎間盤具有增大脊柱運(yùn)動幅度、承受壓力、緩沖震動、保護(hù)大腦和脊髓的作用[6]。IVD 變性是由細(xì)胞驅(qū)動的髓核細(xì)胞退變、髓核細(xì)胞外基質(zhì)退變、軟骨終板和纖維環(huán)退變，其中最主要的是髓核細(xì)胞的減少與細(xì)胞外基質(zhì)改變，導(dǎo)致髓核(NP)和纖維環(huán)(AF)機(jī)械故障，AF 進(jìn)行性破裂，最終導(dǎo)致NP 突出，這一過程同時伴隨著血管的生長和刺激性神經(jīng)纖維進(jìn)入炎癥椎間盤，進(jìn)而使免疫細(xì)胞浸潤，伴發(fā)疼痛。IVD 變性可因過度的體力勞動、潛在的遺傳因素和衰老而加劇[7,8]。目前的治療方案有限，主要以緩解疼痛癥狀為主，而不是糾正病理改變。治療上包括保守治療和手術(shù)治療。保守治療包括服用止痛藥物及抗炎藥物、理療等。其次是手術(shù)治療，手術(shù)治療是保守治療無效的最終方法，但是椎間盤摘除、脊柱融合等手術(shù)成本高，其治療結(jié)局并不十分令人滿意，而且容易加速鄰近節(jié)段退變。生物治療旨在恢復(fù)IVD 穩(wěn)態(tài)并使受損組織再生，主要是恢復(fù)NP 和AF 組織的結(jié)構(gòu)和功能。因此，生物療法在臨床前研究中展現(xiàn)出了前景，生物療法包括生物分子療法、細(xì)胞療法、組織工程方法。生物分子療法是通過誘導(dǎo)細(xì)胞減少分解因子，或者增加合成因子，從而促使細(xì)胞外基質(zhì)再生。生物分子和基因療法能夠在蛋白和基因水平改變細(xì)胞生物合成，其中一類因子—生長分化因子( GDFs )具有關(guān)鍵作用，包括促進(jìn)NP 細(xì)胞的分化和維持軟骨組織穩(wěn)態(tài)[9-12]。因此本文重點(diǎn)關(guān)注GDF 家族對IVD 修復(fù)再生的潛在治療作用。

1 椎間盤(IVD)的結(jié)構(gòu)、功能及退變

椎間盤(IVD)包括三個部分：髓核(NP)、纖維環(huán)(AF)和軟骨終板( CEPs )，構(gòu)成人體中最大的無血管結(jié)構(gòu)。IVD 的性質(zhì)和功能取決于其特定的微結(jié)構(gòu)，而這些微結(jié)構(gòu)又由不同的細(xì)胞群體產(chǎn)生。NP是一種富含陰離子蛋白多糖的細(xì)胞外基質(zhì)，以聚糖為主，它們以27：1 的比例(聚糖：膠原) 排列在不規(guī)則的Ⅱ型膠原網(wǎng)中[13-17]。陰離子蛋白多糖分子的高密度特性能夠吸引并保留水分，使NP 能夠抵抗壓力載荷。NP 由AF 包圍，纖維環(huán)由外、中、內(nèi)三層呈同心圓排列的纖維構(gòu)成，纖維環(huán)中外層纖維緊密地附著于兩個椎體的垢環(huán)之間，內(nèi)層纖維連于上下軟骨終板上，纖維環(huán)2/3 由膠原組成[18-20]。AF 外層95 %以上為Ⅰ型膠原蛋白，在靠近NP 的部分Ⅰ型膠原蛋白數(shù)量幾乎呈線性降下至5 %以下。CEPs 固定并維持NP 和AF 的位置和形狀，并且充當(dāng)半透膜屏障，支持營養(yǎng)物質(zhì)和液體交換[21-24]。

椎間盤變性時，NP 細(xì)胞合成的Ⅱ型膠原逐漸被Ⅰ型膠原取代，蛋白多糖合成減少，導(dǎo)致NP 與AF 的界限不清。蛋白多糖含量是維持NP 正常功能的重點(diǎn)，軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白多糖與膠原的比值比髓核細(xì)胞低[25]。椎間盤退變時髓核缺乏保水性導(dǎo)致圓盤高度降低，從而失去將脊柱應(yīng)力均勻分布到纖維環(huán)的能力，從而產(chǎn)生高壓區(qū)。退行性NP 和AF 產(chǎn)生許多促炎細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素( IL )、干擾素( IFN ) 、腫瘤壞死因子α ( TNF-α )和前列腺素E2 ，這些趨化因子誘導(dǎo)免疫細(xì)胞作用于退行性IVD，從而引發(fā)了NP 和AF 細(xì)胞的一系列病理反應(yīng)，包括NP 標(biāo)記基因失調(diào)，以及引發(fā)自噬、衰老和凋亡等反應(yīng)[26-28]。同時退行性NP 和AF 細(xì)胞增加了基質(zhì)降解酶的表達(dá)，加速了Ⅱ型膠原和富含蛋白多糖的ECM 的丟失。對于椎間盤，特別是髓核再生治療的重點(diǎn)是阻止退變進(jìn)程、恢復(fù)正常ECM 生成、逆轉(zhuǎn)分解代謝進(jìn)程以及減少炎癥反應(yīng)。

2 當(dāng)前椎間盤退變治療和再生治療的進(jìn)展

保守治療椎間盤退變可促進(jìn)輕度退變的椎間盤自我修復(fù)，這些療法可以改善患者的生活質(zhì)量，但并不能阻止IVD 退變進(jìn)程。當(dāng)保守治療失敗時，手術(shù)作為最終選擇，在已發(fā)生IVD 突出的地方行椎間盤切除仍是手術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，脊柱融合得到了廣泛的應(yīng)用[29]。盡管短期內(nèi)效果良好，但是由于所有手術(shù)過程都是有創(chuàng)且不可逆轉(zhuǎn)的，術(shù)后可能出現(xiàn)手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥，如脊柱的應(yīng)力改變，脊柱融合可能導(dǎo)致鄰近融合部位的IVDs 加速退變[30]。

總之，目前可用的手術(shù)治療方案缺乏在必要的細(xì)胞和分子水平上中止和糾正IVD 退變級聯(lián)反應(yīng)和炎癥環(huán)境的能力。分子生物學(xué)和生物材料學(xué)的進(jìn)步使IVD 再生療法變得切實(shí)可行。隨著對IVD 生理學(xué)以及退變病理學(xué)的認(rèn)識不斷提高，人們提出的與之相關(guān)的治療方案和分子靶點(diǎn)的數(shù)量也不斷增加，包括細(xì)胞材料和脫細(xì)胞生物材料植入、基于信號蛋白的轉(zhuǎn)化生長因子和基因療法等。目前臨床上最簡單、最經(jīng)濟(jì)的方法是向局部注入生物活性分子，如生長因子、形態(tài)發(fā)生因子、抗代謝因子、小分子抑制劑、細(xì)胞因子或趨化因子等[31]。然而，由于生物活性因子復(fù)合物潛在的可變性和不可預(yù)測性，目前的研究主要集中在尋找具有治療潛力的單一生物分子上，最常用的候選分子是抗分解/合成代謝蛋白，其目的是恢復(fù)IVD 的穩(wěn)態(tài)，特別是恢復(fù)NP 的代謝平衡[32]。GDF 家族成員(包括GDF5(BMP14，CDMP-1)、GDF6(BMP-13，CDMP-2)和GDF7(BMP-12))可能是IVD 再生的理想分子。GDF 不僅促進(jìn)IVD 細(xì)胞中ECM 基因合成代謝表達(dá)，而且在IVD 的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中具關(guān)鍵作用。

3 IVD 發(fā)育中的生長分化因子、穩(wěn)態(tài)和再生潛力

生長分化因子最早從牛的軟骨中發(fā)現(xiàn)，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP) 家族的成員。GDF 家族成員之間氨基酸同源性為80-86%，與BMP 家族同源性在50% 左右[33,34]。BMP 家族成員在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和氨基酸序列相似性的基礎(chǔ)上，又細(xì)分為BMP2/4 組、BMP-5/6/7/8 組、BMP-9/10 組和GDF5/6/7 組。雖然大多數(shù)BMP成員如BMP-2/4、BMP-7 和BMP-9/10 等均表現(xiàn)出較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)活性，但GDF5/6/7 主要誘導(dǎo)軟骨、肌腱和韌帶樣組織生成[35]。與其他BMP 家族成員一樣，GDF 信號通過含有I 型和II 型受體的跨膜絲氨酸-蘇氨酸激酶受體多聚體傳導(dǎo)。GDF5 和GDF6 通過Ⅰ型受體BMPR-1A 和-1B 及Ⅱ型受體BMPR2、ACVRIIA 和ACVRIIB 起作用[36,37]，除此之外這些途徑還與炎性細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)相關(guān)。最近的證據(jù)表明GDFs 也能激活這些非Smad 途徑，特別是Erk1/2[38]，這些非經(jīng)典BMP 受體提供了諸如GDF6 因子的合成和分解代謝信號傳導(dǎo)途徑，這是IVD 變性的特征之一。GDFs與促炎分子的這種潛在的相互作用表明了退變過程中存在著調(diào)控失調(diào)。在體外，GDF6 增加NP 退化細(xì)胞產(chǎn)生ECM，而在體內(nèi)GDF6 可以阻止羊模型中的ECM 降解[39]。在小鼠模型中，過表達(dá)人GDF6 可使炎癥因子的血漿水平下降[40]。

最近的一篇研究表明GDF6 是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs )分泌的抗衰老因子，其表達(dá)受到miR-17 的調(diào)控，miR-17 是一種隨年齡而下降的microRNA[41]，這可能對與衰老過程密切相關(guān)的IVD 變性進(jìn)展具有重要意義。最近人們對GDF6 在人胎兒脊柱發(fā)育中的表達(dá)及定位進(jìn)行了研究。GDF6 的強(qiáng)表達(dá)尤其表現(xiàn)在發(fā)育早期(孕8-13周)和發(fā)育中期(孕8-19 周)的IVDs 軟骨區(qū)域中。GDF6 表達(dá)定位在NP 和內(nèi)AF，但免疫組織化學(xué)染色未能在外AF 中檢測到[12]。在成年人中，GDF5 和GDF6 在內(nèi)、外AF 中均可檢出，但在NP 中表達(dá)最強(qiáng)烈[42]，這表明GDF 家族對合成代謝基因表達(dá)具有重要性。

4 GDFs 在體內(nèi)對IVD 再生和傳遞方式的影響

GDFs 除了驅(qū)動細(xì)胞分化外，還能促進(jìn)IVD 細(xì)胞的合成代謝，特別是對NP 細(xì)胞和體外軟骨細(xì)胞。這表明GDF 在正常IVD 中具有保護(hù)作用，而在退變性椎間盤中可能失調(diào)。在已報(bào)道的體外培養(yǎng)中，GDF5 和GDF6 對細(xì)胞有相似的作用，在培養(yǎng)物中重組GDF5誘導(dǎo)人NP 細(xì)胞產(chǎn)生更多II 型膠原和蛋白多糖[42]，在小鼠IVD 細(xì)胞、牛NP 和AF 細(xì)胞培養(yǎng)中GDF5 同樣有劑量正相關(guān)性。在牛細(xì)胞培養(yǎng)中GDF5 都使AF 和NP 細(xì)胞的蛋白多糖和膠原蛋白生成增加，但NP 細(xì)胞反應(yīng)更強(qiáng)烈，尤其在蛋白多糖產(chǎn)生方面[43,44]。

Zhang 等通過腺病毒介導(dǎo)的過表達(dá)研究了不同BMP 家族分子對牛AF 細(xì)胞外基質(zhì)生成的影響，發(fā)現(xiàn)GDF6 過表達(dá)誘導(dǎo)生成較多蛋白多糖和膠原[45]。在人NP 和AF 細(xì)胞的3D 藻酸鹽珠培養(yǎng)中添加GDF6 同樣增加了蛋白多糖和膠原數(shù)量[46,47]。這一結(jié)果支持GDF6 同樣可以作為軟骨細(xì)胞趨化劑。綜合來看，這些結(jié)果說明GDF5 和GDF6 在NP 和AF 細(xì)胞合成代謝中具有直接的信號傳導(dǎo)作用，這種作用對正常的NP 細(xì)胞ECM 影響最大。

5 體外補(bǔ)充GDFs 對椎間盤細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的影響

許多生長因子被作為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)NP 樣分化的誘導(dǎo)劑，包括TGFβ、IGF-1、FGF-2 和PDGF[48,49]。然而，這些研究關(guān)注的是一般軟骨形成標(biāo)記物，而不是與NP 分化特定相關(guān)的標(biāo)記物。GDF5 和GDF6 被證明可誘導(dǎo)軟骨形成基因的表達(dá)，更重要的是還可誘導(dǎo)NP 特異性基因表達(dá)。當(dāng)GDF5 作為MSCs 或脂肪干細(xì)胞(ASCs)高濃度培養(yǎng)基的添加劑時，軟骨分化增加，這對于髓核來說是不可取的。然而，在研究NP 細(xì)胞的報(bào)道中存在類似GDF5 反應(yīng)的證據(jù)有限，這意味著目前在干細(xì)胞群體中觀察到的這種反應(yīng)對于GDF5 直接應(yīng)用于退行性椎間盤的意義尚不清楚，需要進(jìn)一步的體外和體內(nèi)研究。

在比較研究中，GDF6 在人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和脂肪干細(xì)胞(ASCs) 中均比GDF5 促進(jìn)更多的NP- 標(biāo)記物基因表達(dá)[50,51]，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多蛋白多糖，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖是正常髓核所必需的。Nochi 等[52]利用腺病毒介導(dǎo)的GDF6 構(gòu)建間充質(zhì)祖細(xì)胞(C3H10T1/2 細(xì)胞)的研究進(jìn)一步支持這一發(fā)現(xiàn)，在使用GDF6時減弱了軟骨內(nèi)骨化的進(jìn)展，增強(qiáng)了NP 標(biāo)記物的表達(dá)、增加了蛋白多糖的生成，同時觀察到比GDF5 更高的糖蛋白/ Ⅱ型膠原比例，有力地說明GDF6 是最有希望從MSCs 或ASCs 中植入NP 細(xì)胞表型的候選物。

6 結(jié)論與展望

生物分子療法治療退行性椎間盤疾病的前景廣闊，在生物分子療法中選擇正確的生物活性分子和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。GDF 家族成員無論是作為直接的趨化因子傳遞給NP 細(xì)胞，還是作為NP特異性分化的誘導(dǎo)因子傳遞給MSCs 或ASCs，都表現(xiàn)出了巨大的前景。無論在哪種情況下，GDF6 均可促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白多糖生成增加，并增強(qiáng)NP 特異性標(biāo)記基因的表達(dá)。今后的研究應(yīng)更深入研究生長分化因子在椎間盤中傳導(dǎo)、控制和釋放機(jī)制。GDF與細(xì)胞治療的結(jié)合應(yīng)用值得關(guān)注，目前人們正在努力尋找治療的最佳細(xì)胞群。由于退行性IVD 的促炎環(huán)境與非經(jīng)典GDF 細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)通路的趨同性，需要進(jìn)一步研究它們之間的相互作用，可能從中找到新的治療靶點(diǎn)，從而優(yōu)化GDF 治療。