青春期隔離應激對實驗動物的行為學研究進展

張雅芳，潘偉成，喬鵬，柳伊麗

(湖州師范學院醫(yī)學院，浙江 湖州)

0 引言

多項研究發(fā)現(xiàn)，社會隔離極有可能威脅到人類的身心健康和生存質(zhì)量，對健康造成的危害可能比肥胖癥更為嚴重[1-2]，引發(fā)酒精濫用、抑郁等行為模式，并誘發(fā)某些精神疾病。而青春期正經(jīng)歷著大腦神經(jīng)解剖，功能和化學重組。在這個神經(jīng)和行為顯著改變的特殊時期[3]，人類在社交、情感和認知方面發(fā)生巨大的改變[4]。影響該發(fā)育階段的壓力因素如隔離，能夠增加個體發(fā)生精神分裂癥等疾病的風險，并容易導致物質(zhì)濫用[5]。已有大量的相關(guān)研究表明，青春期隔離使動物出現(xiàn)焦慮、攻擊、酒精嗜好等各種行為異常[6-7]。其機制與神經(jīng)、內(nèi)分泌等系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的病理改變有關(guān)。故通過對動物模型的研究，旨在闡明青春期隔離對機體行為影響和神經(jīng)生物學機制，為預防和治療社會隔離而產(chǎn)生的抑郁、焦慮等提供實驗依據(jù)，具有重要的學術(shù)價值和潛在應用價值。本文綜合相關(guān)文獻著重從青春期隔離對實驗動物模型的行為改變方面及相關(guān)行為實驗進行闡述。

1 動物模型的制備

實驗一般采用嚙齒動物模型尤其是大鼠、小鼠等，因它們具有行為情緒的變化特征，行為表現(xiàn)多樣，情緒敏感且繁殖力和生命力強，而社會隔離使其產(chǎn)生的負面情感變化和神經(jīng)生理效應與對人類的極其相似[8]，也有研究是以哺乳動物如猴子、魚類等來構(gòu)建模型。其次，動物在青春期展示出比幼年期和成年期更高水平的的社會行為，青春期動物一般在斷奶后21 天( 青春期早期) 開始進行分組隔離，也有研究從中期和晚期開始隔離，有數(shù)據(jù)顯示中期(35 天) 和晚期(42 天) 隔離的產(chǎn)生的行為活動的影響小于早期，包括互動活動如嗅探、對抗行為的頻率、及偏好行為等[9]，也有研究表明在青春期早期和中期，動物的抑郁狀態(tài)特征隨著年齡的增大而愈加明顯[10]。實驗隔離的時程一般選擇在6-7周，也有一些時長為2-3 周的短期隔離，一項研究表明小于3 周的隔離不會導致抑郁樣改變，且社會交互實驗數(shù)據(jù)也沒有統(tǒng)計學意義[11]。因此，本文總結(jié)了動物模型特別是大鼠、小鼠在青春期經(jīng)歷隔離應激表現(xiàn)出行為方面變化，為未來進行相關(guān)研究提供發(fā)展方向的思考。

2 青春期隔離對動物行為的影響

2.1 焦慮相關(guān)行為

動物的焦慮行為可通過高架十字迷宮、曠場實驗等行為實驗進行量化。

2.1.1 高架十字迷宮

高架十字迷宮：利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態(tài)[12]。觀察指標包括：開放臂進入次數(shù)、開放臂停留時間，閉合臂進入次數(shù)，閉合臂停留時間。進入開放臂次數(shù)及停留時間與大鼠的焦慮成負相關(guān)，進入開臂的頻次和停留時間越短，表明動物焦慮狀態(tài)越嚴重。先前大量實驗提示動物在青春期受到隔離應激會表現(xiàn)為進入開臂頻次和開臂停留時間的減少，出現(xiàn)焦慮樣的情緒。雄性小鼠隔離3 周后，停留閉合臂中的時間延長[13]。雌性小鼠隔離8 周后，也出現(xiàn)焦慮樣行為，進入開臂頻次和停留時間顯著減少[14]。這種變化可能與隔離時長有關(guān)，先前已有研究表明，在青春期3 至10 周的社會隔離狀態(tài)下，嚙齒類動物表現(xiàn)出類似焦慮的行為，最近有報道稱雄性青春期大鼠隔離2 周而不是1 周后則出現(xiàn)停留開臂時間顯著縮短、閉合臂時間顯著延長等行為[15]。同時許多研究闡示，性別可能與這種行為改變有一定關(guān)系，雌性會因受到發(fā)情周期的影響而有時掩蓋其焦慮樣狀態(tài)。PND( 產(chǎn)后)21 天雄性大鼠隔離6 周后，于新環(huán)境中表現(xiàn)出更大的運動活性，進入開臂頻次和停留時間明顯減少[16]。而雌性隔離后，和群居鼠在開臂頻次、開臂時間、閉合臂頻次及時間等參數(shù)上均沒有統(tǒng)計學差異[17]。有相關(guān)研究證實，大鼠斷奶后社會隔離誘導的焦慮可通過阻斷中縫背核內(nèi)的CRF2 受體逆轉(zhuǎn)，提示CRF2 受體可能是早期生活壓力源后治療焦慮癥的重要靶點。通過在側(cè)腦室注射MC4 受體的選擇性拮抗劑，焦慮癥狀減輕，通過免疫組化顯示大鼠室旁核(PVN)、弓狀體(ARC)、下丘腦背側(cè)核(DMND)、腹側(cè)核(DMNv)、杏仁核(CEA)中內(nèi)源性α-黑素細胞刺激素(α-MSH)可能參與焦慮狀態(tài)[18]。另外有實驗顯示四種柑橘葉子提取物能夠增加小鼠在開臂中停留的時間，這可能是由于提取物中的黃酮類和萜類化合物用通過調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸(GABA)受體增加氯離子通道開口的頻率和引起神經(jīng)元超極化，起抗焦慮劑的作用[19]，這些為闡明隔離誘導焦慮行為的神經(jīng)生物學機制提供新的思路。

2.1.2 曠場實驗

曠場實驗：利用實驗動物探索新場所的好奇心和畏懼新場地產(chǎn)生的趨避性來評價動物的自發(fā)行為和焦慮狀態(tài)[20]。測量運動距離可反映動物的運動活性，通過記錄實驗動物進入中央?yún)^(qū)域的頻次和停留時間來反映焦慮情況，中央?yún)^(qū)域停留時間減少表示焦慮樣情緒的出現(xiàn)及探索性的減弱。早先研究揭示青春期受到隔離應激的動物往往會表現(xiàn)出運動增多[10]。同時，隔離引起動物在中心區(qū)域探索和停留時間減少，表現(xiàn)出焦慮樣情緒。PND21 雄性大鼠隔離6 周在曠場實驗中出現(xiàn)顯著增加的焦慮性行為[21]。這種行為與隔離時長有一定關(guān)系，3 周及以上隔離可使動物出現(xiàn)焦慮性行為，隔離時長過短可能無法誘導出焦慮樣情緒，而再社會化無法逆轉(zhuǎn)隔離引起的焦慮行為增加。之前有研究對6 周齡雄性小鼠持續(xù)隔離5 周，曠場實驗測量其在開放象限和中心區(qū)域花費的時間，前2 周基本沒有變化，3 周以后開始出現(xiàn)焦慮相關(guān)的行為，5 周之后焦慮相關(guān)的行為顯著增加[22]。隔離2 周再社會化3 周的雄性大鼠和隔離3 周再社會化2 周的雌性大鼠仍出現(xiàn)中心區(qū)域探索行為減少[23]?，F(xiàn)有研究利用在小鼠中心杏仁核(CeA)注射催產(chǎn)素(OXT)減弱了5 周隔離誘導出的焦慮相關(guān)行為，OXT 通過催產(chǎn)素受體(OXTR)恢復CeA 中抑制性突觸傳遞的功能，提示OXT 可作為抗焦慮藥改善長期隔離引起的焦慮相關(guān)的缺陷[22]。

2.2 抑郁相關(guān)行為

2.2.1 強迫游泳實驗

強迫游泳實驗是迫使動物在有限空間里游泳而無法逃脫，進而產(chǎn)生絕望行為的一種應激抑郁模型[12]。通過測量動物在強迫游泳實驗中的掙扎時間和不動時間來反映抑郁，掙扎時間的縮短和不動時間的延長表明“抑郁”行為的出現(xiàn)[24]。已有大量報道表明青春期隔離應激誘導動物出現(xiàn)不動時間的增加、掙扎時間的縮短，而這種改變可能與性別有一定關(guān)系，雌性由于受到發(fā)情周期的影響，實驗往往呈現(xiàn)出較大的差異性。PND21 雄性大鼠隔離6 周表現(xiàn)出不動時間的顯著延長[25]。在雄性大鼠群體中，從PND36 隔離2-3 周內(nèi)未出抑郁樣行為，而雌性隔離組表現(xiàn)出漂浮潛伏期和掙扎時間的減少[26]，小鼠群體隔離5 周雌性比雄性呈現(xiàn)更少的不動性，表現(xiàn)出抑郁行為[27]。這種抑郁相關(guān)行為改變可能還與隔離日齡有關(guān)，青春期早期隔離相對晚期更能誘導出動物的抑郁樣行為，連續(xù)5 周測量PND42 小鼠強迫游泳實驗，前3 周幾乎沒有變化，第4 周開始出現(xiàn)不動時間延長，第5 周出現(xiàn)顯著的抑郁行為改變[22]，而從斷奶后開始隔離，小鼠隔離3 周、大鼠短期隔離1 周即可誘導抑郁[28-29]。有研究提示跑步鍛煉可以改善由隔離誘導的抑郁行為，8 周的跑步運動可顯著降低雄性大鼠強迫游泳的不動時間，運動提高了神經(jīng)生長因子(NGF)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和突觸蛋白I 的水平，還誘發(fā)了海馬神經(jīng)元的存活，而且還通過增加中縫核中5-羥色胺能細胞的數(shù)量來改善抑郁[23]。

2.2.2 蔗糖偏好實驗

蔗糖偏好實驗反映動物對獎賞的反應程度[30]，對獎勵刺激缺乏興趣代表快感的缺失，這是一種情感障礙(包括抑郁癥)的表現(xiàn)形式[31]。通過測量蔗糖溶液和清水攝入量，計算蔗糖偏好率為蔗糖溶液消耗量(g)占清水和蔗糖溶液總消耗量的百分比，蔗糖偏好降低是抑郁癥的重要表現(xiàn)形式。大部分研究顯示青春期社會隔離會引起動物蔗糖攝入量的減少和蔗糖偏愛程度的降低，表現(xiàn)出不同程度的快感缺失。PND21 雄性大鼠隔離6 周和雄性小鼠隔離4 周后都出現(xiàn)了蔗糖消耗量減少和偏好程度降低的情況[32]。最近有報道提示這種偏好改變與蔗糖攝入時長有關(guān)，雌雄大鼠在蔗糖偏好實驗的6h 和12h 的時間點上都表現(xiàn)出偏好顯著降低的現(xiàn)象，在24h 的時間點上則沒有觀察到[33]。有實驗揭示通過鼻內(nèi)施用NT4-NAP(一種衍生的肽) / AAV(重組腺相關(guān)病毒)可改善抑郁行為，改善因隔離應激而引起的蔗糖偏好程度降低的情況。此外，通過3 周施用藥物氟西汀增加了小鼠的蔗糖攝入，并且實時PCR顯示該藥物的施用恢復了應激引起的下丘腦GRPR(胃泌素釋放肽受體) mRNA 和蛋白表達增加，這表明氟西汀作為抗抑郁藥可改善壓力應激下引起的興趣降低等行為缺陷[34]。

2.3 乙醇攝入行為

生命早期暴露于慢性應激往往會導致乙醇攝入異常，引發(fā)乙醇使用障礙[35]。實驗通過測量乙醇、水的消耗量以及血液中的乙醇濃度來評估乙醇的攝入及偏好。大量證據(jù)表明，不論雌性和雄性，青春期隔離應激會增加動物乙醇消耗，表現(xiàn)出乙醇的偏好。PND28 雄性大鼠隔離6 周和8 周，引起間歇性的消耗乙醇增加，相對水更優(yōu)先，血液中的乙醇濃度也顯著升高[36-37]。斷奶后隔離39 天，雌雄性小鼠都表現(xiàn)出了消耗乙醇量的顯著增加[27]，而哌替啶、普洛萘爾、度洛西汀等藥物可以減少暴食樣乙醇攝入[14-15]。有報道稱2g / kg 乙醇誘導青春期隔離組大鼠伏隔核(NAc) 中的多巴胺(DA) 和去甲腎上腺素(NE) 釋放增加，引起乙醇消耗顯著增加，表明該神經(jīng)物質(zhì)可能參與隔離應激下乙醇攝入改變[38]。

2.4 精神分裂行為

前脈沖抑制(PPI)：是指利用震驚反射系統(tǒng)研究動物對突然的強烈刺激的反應以及數(shù)據(jù)分析。動物表現(xiàn)出的PPI 缺乏已成為精神分裂癥和其他神經(jīng)精神疾病遺傳模型的標準行為測量之一[39]。給予實驗動物聽覺刺激，觀察是否出現(xiàn)弱感覺刺激，表現(xiàn)出震驚反射的抑制作用，這種作用即為PPI。早先大量實驗證明，動物青春期隔離可引起動物PPI 的持續(xù)性降低，這一表現(xiàn)可能與動物隔離開始日齡有關(guān)。有研究將雄性大鼠分別在PND28 與PND21 斷奶隔離8 周，PND28 組大鼠顯示出明顯更高的PPI 缺陷率，這提示PPI 受損的大鼠的可行非藥理學模型可能需要在PND28 開始進行隔離[40-41]。而這種由隔離誘導出這種PPI 損傷可以為許多抗精神藥物治療所逆轉(zhuǎn)。DA 拮抗劑、藥物奧氮平可逆轉(zhuǎn)因隔離飼養(yǎng)誘導的PPI 缺陷，并傾向于增加基礎(chǔ)PPI 水平[22]。有研究提示藥物加蘭他敏通過M 1 受體的激活改善了社會隔離誘導的PPI 缺陷，東莨菪堿(非選擇性毒蕈堿拮抗劑)和西侖西平(M 1 受體拮抗劑)可抑制加蘭他敏的作用[42]。另外，有研究顯示隔離大鼠中會出現(xiàn)熱休克蛋白60(HSP60) 升高，α- 突觸核蛋白(α-syn) 和14-3-3蛋白(zeta /δ) 顯著降低的現(xiàn)象，這些變化與PPI 缺陷的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)，為隔離應激誘導的精神病樣行為提供神經(jīng)化學基礎(chǔ)[43]。

2.5 攻擊性行為

入侵者實驗：是評價對外來入侵者的攻擊行為和社會交往行為的一種實驗方法。通過移入刺激鼠，觀察實驗動物的撕咬、追趕等攻擊性行為，記錄攻擊潛伏期、攻擊頻率、攻擊持續(xù)時間等來判斷動物的攻擊性行為[44]。早有證據(jù)發(fā)現(xiàn)實驗動物在青春期受到社會隔離攻擊性會顯著增加，這種變化可能存在隔離時間差異的影響。青春期大鼠、小鼠經(jīng)歷連續(xù)隔離后，表現(xiàn)出更短的攻擊潛伏期、更長的攻擊持續(xù)時間及明顯減少的非侵略社會接觸時間[45-46]，PND21(青春期早期)和PND45(青春期晚期)小鼠隔離6 周后都出現(xiàn)了攻擊性增加，且早期隔離引起的攻擊性增加更顯著[47]。后來攻擊時間等不同，可能由于不同種系具有不同的遺傳和環(huán)境相互作用。昆明小鼠隔離4 周、8 周表現(xiàn)出增加的攻擊性，而2 周隔離足以引起B(yǎng)ALB/c 小鼠攻擊性增加，在相同隔離時間刺激下，昆明小鼠相對BALB/c 小鼠表現(xiàn)出更短的攻擊潛伏期、更長的攻擊持續(xù)時間[48]。斷奶后雄性小鼠的侵略性和活動性顯著加強，隔離早期較晚期出現(xiàn)更快更嚴重且更持久的攻擊性行為，測試還顯示了使用S-氟西汀、Allo 類似物、內(nèi)源性大麻素、N-棕櫚酰乙醇胺等物質(zhì)可以降低隔離引起的攻擊性升高現(xiàn)象[47]。此外，青春期隔離引起攻擊性增強的機制可能與杏仁核中的ADAR1(p110) 蛋白表達和免疫反應性下降有關(guān)，并且實驗通過免疫組織化學和蛋白質(zhì)印跡法證明了5-HT(5-羥色胺)受體拮抗劑和反向激動劑可以通過恢復ADAR1(p110)蛋白的表達來緩解攻擊性行為[49]。

2.6 空間學習和記憶方面

Morris 水迷宮：Morris 水迷宮是利用小鼠尋找水中休息場所的本能，通過定位航行實驗和空間探索實驗用于評估嚙齒類動物空間學習和記憶能力。觀察并記錄動物入水并找到藏在水下逃避平臺所需的時間(潛伏期)、游泳軌跡(總路程)等，分析和推斷動物的空間學習和記憶等方面的能力。青春期隔離引起動物在水迷宮實驗中表現(xiàn)出的行為并不一致，可能引起的空間記憶能力損傷受隔離時長的潛在影響，隔離時間過短會出現(xiàn)空間記憶沒有損害的陰性結(jié)果。雄性大鼠從PND21 隔離2 周空間學習能力沒有受損[50]。相似的是，大鼠隔離6 周后對空間位置的學習能力總體上沒有差異[51]。而最近研究表明3 周齡雄性大鼠隔離90 天后出現(xiàn)空間學習記憶受損[52]。雄性小鼠隔離25 周，出現(xiàn)空間記憶能力的損害[53]。有報道稱腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)作為神經(jīng)系統(tǒng)分泌的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，對大腦發(fā)育至關(guān)重要(包括海馬功能、突觸可塑性和學習記憶)，而通過長期運動訓練可改善隔離誘導的海馬BDNF 和NGF 含量降低的情況，改善認知障礙和學習記憶能力[52]。

3 總結(jié)

綜上所述，以動物為研究對象構(gòu)建青春期隔離模型，為藥物試驗提供了平臺，對研究人類社會隔離具有重要意義。已有多項研究表明青春期隔離會引起動物多種行為顯著和持續(xù)的改變，相關(guān)行為的影響是種系、性別、隔離時長等各因素綜合作用的結(jié)果。此外，探究焦慮、抑郁、成癮等行為的機制有助于闡明人類異常精神疾病的神經(jīng)調(diào)節(jié)過程，進一步預防、研制治療藥物、治療提供了理論基礎(chǔ)和新的思路。