結(jié)直腸癌納入標準對腸道菌群分析的影響△

吳思宇，馬玉芳

武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院腫瘤科，武漢4300640

結(jié)直腸癌是一種多因素疾病，從20 世紀末開始，人們就關(guān)注到腸道菌群是結(jié)直腸癌甚至腺瘤性息肉（adenomatous polyp，AP）的潛在危險因素，但限于取樣、實驗技術(shù)等各種因素，有關(guān)結(jié)直腸癌致病菌群的研究一度停滯。隨著高通量測序和分子生物分類等方法迅速填補傳統(tǒng)微生物學(xué)技術(shù)存在的空白，以及人類腸道微生物群及其相關(guān)代謝譜綜合目錄的建立，21 世紀初各種相關(guān)試驗呈如火如荼之勢。更令人驚喜的是，腸道主要菌群的檢出和潛在生物標志物的發(fā)現(xiàn)為早期檢測結(jié)直腸癌及尋找治療靶點提供了參考依據(jù)。但由于全世界檢測結(jié)直腸癌腸道菌群的單個試驗樣本量往往較小，且無法因研究人群的年齡、地區(qū)、基礎(chǔ)疾病等差異做出相應(yīng)調(diào)整，嚴重影響了研究者分析腸道菌群的豐度及與結(jié)直腸癌的關(guān)系[1-5]，甚至還出現(xiàn)了研究結(jié)果不一致的現(xiàn)象[6-7]。本研究從以下方面綜合分析結(jié)直腸癌腸道菌群的影響因素：性別、年齡、地區(qū)、飲食習(xí)慣、既往病史、抗生素和益生菌使用情況、檢測部位、檢測樣本等，旨在綜合考量混雜因素，厘清納入人選條件，現(xiàn)報道如下。

1 性別與年齡因素

研究表明，男性結(jié)直腸癌的發(fā)病率較高，女性則易患近端結(jié)腸腫瘤，且性別不同的結(jié)直腸癌患者的發(fā)病率也會隨年齡增長而發(fā)生變化[8]。有研究證實腸道菌群可以影響人體內(nèi)雌激素水平，進而在一定程度上抑制某些惡性腫瘤的發(fā)生[9]。目前有關(guān)結(jié)直腸癌腸道菌群的研究在納入人選時大多數(shù)已考慮性別對結(jié)果的影響，且大型薈萃分析可以使男女比例大體相當。

年齡與結(jié)直腸癌的發(fā)病率及部位有關(guān)。研究表明，年長者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險更大[8]。隨著高齡患者對此病的重視及結(jié)直腸鏡檢查的普及，整個結(jié)直腸癌群體正在年輕化[10]。大多數(shù)研究的試驗組患者（結(jié)直腸癌患者）較健康人群的平均年齡偏大，考慮與結(jié)直腸癌發(fā)病率隨年齡增高有關(guān)。有研究顯示，具核梭形桿菌（Fusobacterium nuclea‐tum）在年齡較大的結(jié)直腸癌患者中具有重要作用，尤其是右側(cè)腫瘤患者[11]。此外，有研究正在調(diào)查年齡對腸道菌群的影響，以期發(fā)現(xiàn)年輕患者中特定的致癌細菌[12]。

2 地區(qū)及飲食因素

地區(qū)及飲食是目前臨床試驗中涉及較少的因素。飲食方式對腸道菌群的組成、多樣性和代謝能力均具有重要影響，因此飲食結(jié)構(gòu)對結(jié)直腸癌腸道菌群研究的納入人選具有較大干擾。大多數(shù)納入研究人群為西方人，其生活方式及飲食習(xí)慣與中國人群有很大差別。巨單胞菌屬（Megamo‐nas）從未被歐美國家報道，但中國結(jié)直腸癌腸道菌群實驗卻對其進行了關(guān)注[13]。提示針對西方人群的潛在腸道生物標志物可能對中國人群并不適用，需要擁有中國人群腸道菌群的臨床研究。

一項臨床試驗將在美國生活的不同種族人群的腸道菌群和飲食進行了對比，發(fā)現(xiàn)攝入脂肪、蛋白質(zhì)、肉更多的非洲裔美國人較非西班牙裔白人腸道菌群中存在更多的硫化細菌[14]。有研究將中國瑤族人群中的糞便微生物組與生活在同一農(nóng)村地區(qū)的主要少數(shù)民族（壯族）和主要漢族人群的糞便微生物組進行了比較，發(fā)現(xiàn)食用豆類較多的瑤族人群的糞便樣本中巨單胞菌屬的相對豐度最低，擬桿菌屬（Bacteroides）的豐度較高，但隨著飲酒量的增加，普氏菌屬（Prevotella）的豐度減少[13]。這一研究意味著即使在中國同一地區(qū)，飲食習(xí)慣不同也會導(dǎo)致腸道菌群存在明顯差異。先前的研究很少涉及非洲和東南亞群體，相關(guān)研究進展會使結(jié)直腸癌腸道菌群信息更完善，數(shù)據(jù)更可靠[5]。

過濾掉地區(qū)因素后的菌群（如具核梭形桿菌）就是結(jié)直腸癌致病菌群Meta分析尋求的答案[5,11,15-17]，這些菌群將給全世界的結(jié)直腸癌患者帶來福音，使人們更深入地了解結(jié)直腸癌的微生物學(xué)發(fā)病起因。對結(jié)直腸癌腸道菌群研究中納入人選的飲食習(xí)慣進行較為詳盡的問卷調(diào)查，從而分析其對腸道菌群的影響也是了解地區(qū)因素導(dǎo)致的腸道菌群差異化的方式之一。

3 相關(guān)疾病與結(jié)直腸癌

腸道菌群與疾病之間有著千絲萬縷的聯(lián)系，例如腸道細菌中大腸桿菌（Escherichia coli）的過度生長可能會導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[18]，惡性黑色素瘤、肺癌人群的免疫治療療效與腸道菌群有關(guān)[19]。有研究提出肥胖與腸道菌群之間可能沒有關(guān)聯(lián)[20]，而有的研究卻發(fā)現(xiàn)肥胖者與體型正常者的腸道菌群存在顯著差異[21]。炎癥性腸病、2 型糖尿病、過敏等均與腸道微生物群組成的改變有關(guān)[22]。慢性腸道炎癥疾病，例如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，是由針對自身共生菌群的過度免疫反應(yīng)引起的[23]。現(xiàn)有研究在試驗后期數(shù)據(jù)處理上開發(fā)了區(qū)分糖尿病、炎癥性腸病和結(jié)直腸癌的特異性微生物特征的處理方法[3]，但針對其他疾病的特異性微生物特征的處理方法還有待進一步研究。因此在后期數(shù)據(jù)處理較困難的情況下，盡可能考慮并記錄體重指數(shù)（body mass index，BMI）及納入人選是否患有其他疾病，尤其是對腸道菌群存在影響的疾病十分必要。

4 是否使用過抗生素、益生菌、抗腫瘤治療

抗生素已被證實對腸道菌群具有影響[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗生素組（5 例頭孢類及2 例喹諾酮類）納入研究人群腸道菌群中難辨梭菌（Clostridium difficile）、遲緩埃格特菌（Eggerthella lenta）、扭鏈瘤胃球菌（Ruminococcus torques）的豐度較未用抗生素組顯著下降[25]。因此，目前大部分病例對照研究均已考慮抗生素產(chǎn)生的影響，并將其納入了排除標準。

益生菌對腸道菌群的影響也相繼被發(fā)現(xiàn)[9,26-27]。有研究指出，補充益生菌組納入研究人群糞便中的梭菌（Clostridium）、Dorea 菌（Dorea formicigenerans）、乳酸桿菌（Lactobacillus）的豐度呈數(shù)倍升高[25]。但在了解益生菌對腸道菌群的顯著影響前，很少有臨床對照試驗[25,28]會排除入組前1 個月內(nèi)飲用腸道益生菌、酸奶等乳酸菌制品的腫瘤患者，但也有研究會在結(jié)腸鏡檢查的前一天，向受試者提供相同的無乳酸菌制品飲食[29]。因此在未來的研究中需要考慮益生菌對研究結(jié)果的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，其他惡性腫瘤（非小細胞肺癌和腎細胞癌）患者在接受程序性死亡受體1（pro‐grammed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）抑制劑治療后，某些腸道菌群存在顯著變化[19]。有研究將納入研究人群接受化療或免疫治療前后的腸道菌群進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組患者治療后未見菌群變化，然而食管癌、胃癌組患者卻有細菌豐度變化[25]。上述研究結(jié)果可能與納入研究人群的樣本量較少有關(guān)，抗腫瘤治療對腸道菌群的影響究竟有多大，需要進一步擴大樣本量分析。

5 檢測部位

研究表明，與遠端結(jié)腸和直腸相比，近端結(jié)腸中更容易檢測出具核梭形桿菌[11,15,30]。與左側(cè)結(jié)直腸癌患者相比，右側(cè)結(jié)直腸癌患者中大腸桿菌phylogroup B2 在統(tǒng)計學(xué)上的發(fā)生率更高[31]。年齡較大的人群（65 歲及以上）中近端結(jié)腸腫瘤最常見，年齡較小的人群（＜50 歲）易患直腸腫瘤，其次是遠端結(jié)腸癌[8]。腫瘤在左側(cè)或右側(cè)對患者的整體生存期有影響，且兩側(cè)基因突變的發(fā)生率也存在差異[32]。這些腸道菌群的差異又會涉及結(jié)直腸鏡腸準備不同所帶來的差異。因此所得結(jié)果能否客觀表示腸道菌群的變化還需進一步研究。

同時還要考慮同一結(jié)直腸癌患者的健康黏膜組織和腫瘤組織之間的腸道菌群差異是否可以代表與惡性腫瘤相關(guān)的菌群組成這一問題。不止一個研究將結(jié)直腸癌癌變的黏膜組織與周圍健康組織中的腸道菌群進行了對比分析[33-34]。Burns 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中微生物的多樣性增加，具核梭形桿菌和普羅威登斯菌（Providencia）富集。這支持了腸道菌群在結(jié)直腸癌的進展中具有不可或缺的作用，但同時也提示納入研究人群的取材部位十分重要。那么結(jié)直腸癌患者腸道菌群的改變是否僅局限于腫瘤組織？針對這點疑惑，解決方式是多點取樣、重復(fù)取樣。

6 結(jié)直腸癌分期

大多數(shù)散發(fā)性結(jié)直腸癌是由息肉、腺瘤一步步進展而來，過程可長達幾十年[35]。納入結(jié)直腸癌患者的臨床分期對研究結(jié)果具有重要影響。Yachida等[36]研究表明，結(jié)直腸癌患者腸道菌群有兩種物種升高模式，具核梭形桿菌的水平從早期結(jié)直腸黏膜內(nèi)癌至疾病進展到晚期一直上升。而極小鏈球菌（Atopobium parvulum）和齲齒放線菌（Actinomy‐ces odontolyticus）僅在疾病早期升高顯著。關(guān)于同一種細菌，還存在著不同的結(jié)論。有研究指出具核梭形桿菌是惡性腫瘤發(fā)展早期從腺瘤進展為癌的危險因素，甚至在肝轉(zhuǎn)移患者中也扮演著一定角色[37-38]。另有研究提示具核梭形桿菌的豐度在息肉組與正常對照組間并無差異，但糞便中具核梭形桿菌的定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）結(jié)合其他生物標志物或許可以作為早期檢測結(jié)直腸癌的非侵入性方式[15]。除了具核梭形桿菌，大腸桿菌強毒株在結(jié)直腸癌的進展過程中同樣具有顯著變化[31]。值得慶幸的是，在意識到疾病發(fā)展是個動態(tài)演變的過程后，大量病例對照研究和隊列研究開始關(guān)注結(jié)直腸癌發(fā)展各個階段對腸道菌群的影響。早期及晚期結(jié)直腸癌患者微生物組的變化特征能夠幫助人們更深入地了解結(jié)直腸癌的病因，并為早期診斷提供依據(jù)。

7 檢測樣本及方法

早前因為各種因素，大多數(shù)研究直接將糞便作為檢測樣本。后來有研究指出糞便可能包含與疾病部位無關(guān)的微生物，而活檢僅代表采樣點的微生物，因此糞便會在檢測疾病的潛在生物標志物中引入“噪音”[29]。在尋求結(jié)直腸癌微生態(tài)紊亂的代表菌群上，腸道黏膜樣品似乎比糞便樣品更適合，糞便樣品不能在豐富度和多樣性上代表與腫瘤黏膜組織相同的微生物群。腸道黏膜管腔界面樣品更適合檢測某些產(chǎn)丁酸鹽的細菌，例如真桿菌（Eubacterium）和棲糞桿菌（Faecalibacterium），因為其更適合定植在腸道黏膜表面[28]。但近年來越來越多的試驗表明糞便可以反映結(jié)直腸癌的微生物特征[15-17,37,39]。

腸道菌群分析的準確性很大程度上取決于所采用的方法，而腸道菌群分析的關(guān)鍵步驟之一是選擇基于16S rRNA的擴增子測序，并評估其對腸道菌群分析的影響，但操作存在明顯的技術(shù)差異[40-42]。目前有可將細菌分類鑒定到物種水平的宏基因組全測序（shotgun metagenomics），但除了難度大、成本高、受限于計算機技術(shù)的發(fā)展外，還有分類規(guī)則幾乎未獲獨立研究驗證等問題[5,43]。除此之外，研究設(shè)計、樣本收集、運輸和儲存、測序平臺的選擇、生物信息學(xué)分析流程不同、缺乏標準比較方案等均會造成一定程度上的偏倚。因此有文獻將21 種具有代表性的糞便樣品DNA 提取方案按照獲得DNA 的數(shù)量和質(zhì)量進行了測試并排名[4]。如果普及同一種DNA 提取方案，將大幅度改善全球各地腸道菌群研究結(jié)果的可比性。

8 問題與展望

結(jié)直腸癌是時間變化、個體差異、微生物群演變等多因素導(dǎo)致的，即結(jié)直腸癌可能不只是遺傳疾病，還是微生物疾病。以上這些研究提供的信息對于以安全的非侵入性方式調(diào)節(jié)大量腸道細菌、預(yù)防結(jié)直腸癌以及找到靶向微生物的治療藥物至關(guān)重要。雖然許多研究納入的樣本量較小，但眾多提供大數(shù)據(jù)后期處理方法的研究層出不窮，所有薈萃分析都在盡可能考慮混雜因素對研究結(jié)果的影響，例如糾正批次效應(yīng)[44]、極值分析[6]。隨著各種納入研究人群的相關(guān)信息得到充實，各種推斷被證明，以及結(jié)直腸癌納入標準的制定，將極大程度簡化薈萃分析，防止后期分析時重要物種丟失，為發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者腸道菌群的改變做出貢獻。