梔子苷保肝利膽和肝毒性雙重作用的研究進展

王榮慧，吳 虹 ，王夢蝶，鄧 然，王 言，戴學靜，占 翔，孫明慧，卜妍紅，張 衡

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012； 2.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230012；3. 中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

中藥梔子是茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實，具有廣泛的藥理學作用[1]。梔子含有梔子苷、綠原酸、藏紅花素等活性成分[2]，具有保肝利膽、抗炎、抗抑郁、抗氧化、神經(jīng)保護等多種藥理活性，對糖尿病肝臟損傷、抑郁癥、自身免疫性疾病有一定的防治作用[3-4]。其中，梔子苷作為中藥梔子的主要活性成分在治療肝臟疾病方面發(fā)揮了重要的作用。然而，近年來研究表明，梔子苷具有肝臟毒性，這使得梔子苷的應用受到了一定的限制，阻礙了臨床處方中梔子的廣泛使用。現(xiàn)就梔子苷對肝臟的保護與致毒作用機制作一綜述，為梔子的臨床應用提供參考。

1 梔子苷對肝臟保護作用研究

肝臟是人體內(nèi)最大的器官，也是新陳代謝最主要的器官，具有一定的解毒作用。一般藥物主要通過該器官代謝，藥物本身或其代謝產(chǎn)物會對肝臟造成不同程度的損傷[5]，常見于藥源性肝損傷。此外，一些不良的生活習慣、病原體感染、代謝障礙等，也會對肝臟造成一定的損傷。在研究過程中，大多數(shù)動物肝損傷性模型是由四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)所構(gòu)建。CCl4是一種毒性物質(zhì)，具有促進肝臟脂肪沉積以及小葉中央壞死的作用。Tian等[6]研究發(fā)現(xiàn)，茵陳蒿湯具有肝臟保護作用，其成分中梔子苷含量最高，由此推斷在一定劑量范圍內(nèi)，梔子苷是茵陳蒿湯的主要藥效物質(zhì)，對肝損傷具有一定的保護作用。而吳歡等[7]對正常大鼠灌胃60 mg/kg 梔子苷后，發(fā)現(xiàn)腎臟與肝臟藥物濃度最高，且梔子苷有較好的生物利用度，在體內(nèi)有較好的吸收。

梔子苷對肝臟的保護作用，是通過不同的機制效應來實現(xiàn)的。其中對乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)對肝細胞具有明顯的毒性損傷作用，能夠造成藥源性肝損傷。Yang等[8]觀察梔子苷對APAP造成的急性肝損傷模型小鼠的影響，結(jié)果顯示，梔子苷能夠通過下調(diào)CYP2E1肝微粒體酶活性，同時抑制TLR4/NF-κB信號通路的表達，減少前炎癥因子的釋放，進一步減弱免疫性肝損傷，從而有效地保護肝細胞免受藥物的毒性影響。

梔子苷在臨床相關(guān)肝臟疾病的治療中發(fā)揮重要作用。肝纖維化是肝細胞外間隙Ⅰ型膠原蛋白沉積增多的結(jié)果，會導致肝實質(zhì)和肝結(jié)構(gòu)的破壞。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)在肝纖維化的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用，是膠原蛋白生成的有力誘導劑。小鼠體外研究結(jié)果表明，梔子苷對TGF-β1誘導的Ⅰ型膠原表達有明顯的抑制作用，且信號轉(zhuǎn)導蛋白Smad 2/3、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)和蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)即AKT的磷酸化幾乎完全阻斷。Smad 2/3已被證明是TGF-β1誘導上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵效應因子。由此可以推測，梔子苷能抑制TGF-β1誘導的肝纖維化，這種效應可能與抑制TGF-β1/Smad及ERK/MAPK信號通路有關(guān)[9]。

Rong等[10]對缺血性再灌注模型造成的肝臟損傷進行研究，結(jié)果表明梔子苷能夠誘導PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，其中mTOR能夠進一步抑制炎癥和細胞凋亡，對肝臟損傷具有一定的保護作用。此外，有研究顯示梔子苷對該類肝臟損傷的保護作用與其減少氧化應激，抑制相關(guān)細胞凋亡相關(guān)[11]。

李原明[12]觀察梔子提取物對酒精性肝臟損傷模型大鼠的影響，結(jié)果顯示梔子提取物可能通過下調(diào)炎癥因子水平，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素6(interleukin 6, IL-6)，同時促進脂肪代謝，清除肝組織內(nèi)自由基等，發(fā)揮保肝作用。

2 梔子苷的肝毒性研究

動物實驗表明，梔子苷致大鼠出現(xiàn)明顯肝損傷的劑量為300 mg/kg，換算為60 kg人體用量約為16.48 mg/kg，而臨床中推薦梔子苷治療劑量約為10 mg/kg(依據(jù)梔子苷在梔子中含量為1.8%～6%換算得到)，推測梔子苷造成的肝毒性與臨床治療劑量相關(guān)[13]。

2.1 肝毒性表現(xiàn) 動物實驗中具有明顯肝毒性的大鼠，通常表現(xiàn)為精神萎靡不振，皮毛不凈，墊料藍染等[14]。病理學分析發(fā)現(xiàn)，肝毒性表現(xiàn)為肝臟質(zhì)量增加，局灶性壞死和肝細胞的明顯炎癥浸潤等[15]。此外，由于肝細胞受損，細胞膜通透性增加，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartic aminotransferase, AST)，谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)由細胞內(nèi)逸出導致血清中響應值增高。由于檢測結(jié)果較為靈敏，甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(glycine N-methyl transferase, GNMT)和糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, PYGL)可作為早期出現(xiàn)肝毒性生物標志物[16]。

2.2 肝毒性原因 梔子苷已被證實具有保肝利膽的作用，但在某些條件下，梔子苷對肝臟的作用，可轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆喾吹闹露咀饔谩?/p>

不同種屬動物對梔子苷肝毒性的表現(xiàn)存在差異。劉琦等[17]給予小鼠梔子苷灌胃處理后，發(fā)現(xiàn)小鼠在430 mg/kg劑量下肝毒性不明顯，在860 mg/kg劑量下才出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)。而Tian等[13]研究顯示，當梔子苷劑量大于280 mg/kg時，肝毒性表現(xiàn)已經(jīng)較為明顯。

不同給藥途徑造成肝臟損傷的程度存在差異。楊明等[18]比較梔子苷3種不同給藥方式對肝臟造成毒性損傷的影響，發(fā)現(xiàn)肌肉注射的梔子苷生物利用度最高，滴鼻的梔子苷生物利用度次之，灌胃的梔子苷生物利用度最低。王智勇等[19]實驗研究顯示，梔子苷灌胃、口服的給藥方式相比較滴鼻、肌肉注射的給藥方式對肝臟指數(shù)影響較大，顯著增加肝臟質(zhì)量，由此認為梔子苷口服、灌胃對肝臟的毒性較大。

不同劑量梔子苷對肝臟的作用存在明顯差異性。梔子苷體內(nèi)代謝分析研究顯示，28～100 mg/kg梔子苷對肝臟具有保護作用；對比不同給藥劑量后發(fā)現(xiàn)，梔子苷對大鼠半數(shù)致死劑量為1 431.1 mg/kg，且肝毒性呈劑量依賴性，劑量越大，毒性越大[20]，即過量梔子苷能夠產(chǎn)生肝毒性。Wei等[21]從基因水平上探究過量劑量梔子苷產(chǎn)生毒性反應的機制，發(fā)現(xiàn)梔子苷在治療劑量與過量劑量中具有不同的靶轉(zhuǎn)錄因子，治療劑量下的梔子苷能夠抑制HNF-1ɑ、HNF-4ɑ及PPAR-ɑ靶轉(zhuǎn)錄因子；過量劑量下的梔子苷與能夠引起肝臟損傷靶轉(zhuǎn)錄因子Atf、Jun、Hmga、Irf及Etv的激活相關(guān)，深入闡明梔子苷產(chǎn)生肝毒性的原因與其給藥劑量相關(guān)。

另有研究提出，梔子苷出現(xiàn)肝毒性主要是由其代謝產(chǎn)物京尼平二醛中間體造成的，而腸道中pH值能夠決定這一產(chǎn)物合成，推測肝毒性呈pH依賴性[22]。

2.3 肝毒性機制 梔子苷肝毒性機制可能與其半縮醛結(jié)構(gòu)相關(guān)，Che等[15]對其結(jié)構(gòu)進行改造，通過甲基化梔子苷的C-1位，得到梔子苷衍生物甲基京尼平，實驗中大劑量使用該新合成的產(chǎn)物，毒性作用明顯減弱且藥效不變。另外，在腸道菌群的作用下，梔子苷能夠水解為京尼平(genipin, GP)，GP又可再與一些親核分子結(jié)合，造成肝臟毒性。水解后的GP又可自發(fā)地轉(zhuǎn)變?yōu)槎┲虚g體，共價結(jié)合肝蛋白游離賴氨酸殘基的伯胺基團，在梔子苷肝毒性中起關(guān)鍵作用，且毒性與結(jié)合賴氨酸后的GP含量相關(guān)[22]。

中藥對肝細胞的氧化損傷主要檢測指標有活性氧(reactive oxygen species, ROS)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)等，其中MDA與SOD在肝細胞損傷協(xié)調(diào)機制中起著關(guān)鍵作用。通過對梔子苷在體內(nèi)代謝初步分析發(fā)現(xiàn)，梔子苷在腸道菌群下水解得到的GP可引起ROS含量增加，進一步導致缺血再灌注肝損傷[11,24]。也有研究表明，梔子苷所致肝毒性可能與氧化應激有關(guān)，梔子苷以861 mg/kg劑量給大鼠灌胃，肝組織中MDA水平上升，SOD水平下降，而小劑量組未有明顯差異[20]。然而，另有研究發(fā)現(xiàn)，梔子苷以840 mg/kg劑量給小鼠灌胃，MDA水平較正常組并未有明顯差異[25]。這也提示梔子苷造成氧化應激反應引起的肝臟毒性可能與受試對象不同相關(guān)，且與劑量呈正相關(guān)，僅大劑量的梔子苷可能會出現(xiàn)肝毒性，而一般臨床用藥劑量不會出現(xiàn)氧化應激反應造成的肝損傷。

肝臟中含有藥物代謝所需的許多酶類，其中CYP3A2是一類重要的CYP酶亞型，參與多種內(nèi)源性、外源性物質(zhì)的代謝，其活性高低與藥物的療效或毒性反應密切相關(guān)。周淑娟等[26]對梔子苷造成肝毒性的大鼠進行毒理學研究分析，發(fā)現(xiàn)在62.5 mg/kg梔子苷干預下，肝微粒體酶CYP3A2活性較高，而在250 mg/kg梔子苷干預下，CYP3A2酶活力反而降低。同時，300 mg/kg梔子苷能夠使肝微粒體酶CYP7A1失調(diào)，提示梔子苷造成肝毒性的機制與藥物代謝酶的失調(diào)相關(guān)。此外，300 mg/kg劑量的梔子苷會導致膽汁酸合成增加，而膽汁酸的淤積會進一步導致線粒體損傷，激發(fā)ROS和活性氮物質(zhì)誘導的病理效應，引起肝臟損傷[13]。

綜上所述，梔子苷造成肝毒性的機制與其半縮醛結(jié)構(gòu)相關(guān)。在人體腸道菌群的作用下，梔子苷能夠水解為GP，GP的結(jié)構(gòu)特點也可進一步造成肝臟損傷。由此推測，梔子苷代謝物GP可能為肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。大劑量梔子苷給藥，會引起氧化應激反應，導致肝臟損傷。藥物代謝酶活性異?？赡苁菞d子苷引起肝毒性的機制之一。同時，膽汁酸的淤積、線粒體損傷，可進一步引起一系列的病理效應，加劇肝臟的損傷。

目前，已有學者對梔子苷致肝毒性進行分子水平上的研究，利用毒理基因組學對與肝臟毒性相關(guān)基因進行篩選，確立了5個可能與肝毒性相關(guān)的靶基因，分別為Bcl2、Aldob、Norb2、Cyp2C23、Collα1，這5個標志基因的確證，為日后深入研究梔子苷肝毒性機制奠定了基礎(chǔ)[27]。

3 結(jié)語

梔子作為傳統(tǒng)中藥廣泛應用于臨床，其活性成分梔子苷已被證實可用于多種疾病的治療，包括自身免疫性疾病、心血管疾病等。目前，臨床中尚未出現(xiàn)有關(guān)梔子苷不良反應的報道，但在動物實驗顯示其具有肝毒性。梔子苷具有保肝利膽的藥理活性，對多種原因的肝臟損傷有良好的防治作用，而其肝毒性則限制梔子的臨床應用。梔子苷對肝臟的毒性作用與其用藥劑量、受試對象、給藥途徑以及腸道的pH值的差異相關(guān)。這也提示，梔子的臨床用藥需要制定合理的用藥劑量、用藥周期，切勿過量。因患者個體具有差異性，在臨床用藥過程中，需進行血藥濃度監(jiān)測，制定個體化給藥方案，在發(fā)揮梔子治療作用的同時，避免不良反應的發(fā)生。相關(guān)研究表明，口服給藥對于肝臟毒性的影響較大，由此，可以借助藥物輔料的方式，開發(fā)更為安全的藥物劑型。

國內(nèi)外對梔子苷保肝利膽的作用研究較多，而對梔子苷代謝產(chǎn)物的研究較少，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、代謝途徑、藥理作用等有待進一步評價。梔子苷具體的保護作用機制尚未明確，需進行更加全面的評價與研究，以闡明其藥理作用的真正分子基礎(chǔ)。目前，有關(guān)梔子苷肝毒性作用研究較少，基本停留于動物或者細胞實驗中。前期研究提示，梔子苷肝毒性種屬差異性較為明顯，對人出現(xiàn)肝毒性的劑量還未明確。此外，一些研究認為梔子苷在腸道菌群作用下水解得到的GP為肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)。梔子苷進入體內(nèi)后受β-葡萄糖苷酶作用轉(zhuǎn)化為GP的量是否會影響肝臟毒性？梔子苷與其代謝產(chǎn)物GP對肝臟具有雙重作用，其作用途徑與其在體內(nèi)血藥濃度是否相關(guān)？其作用機制及其分子基礎(chǔ)是什么？這些都有待于進一步研究。