基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合聚乳酸聚羥基乙酸/羥基磷灰石/Ⅰ型膠原雙相支架的生物學(xué)研究

馬鋼，劉曉民，丁良甲，劉長路，高博

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030

關(guān)節(jié)軟骨損傷在臨床十分常見，可由外傷、手術(shù)、感染和退變等引起，多伴有軟骨下骨損傷，修復(fù)骨軟骨缺損是目前較為棘手的難題。 近幾年，由于生物工程和技術(shù)的發(fā)展迅速， 在修復(fù)骨軟骨缺損方面組織工程技術(shù)進步很大。 將基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞，種植到具有三維立體多孔的支架中， 可以模擬骨軟骨組織天然結(jié)構(gòu)中各層次的生物結(jié)構(gòu)、力學(xué)及化學(xué)性質(zhì)，可與缺損病灶周圍的軟骨及軟骨下骨整合，達到更好的修復(fù)缺損目的[1]。 該實驗中我們在前期研究的基礎(chǔ)上，2018 年1 月—2019 年2 月用兩只新西蘭白兔實驗， 選用PLGA 和HAp 制備出一種新型的仿生雙相支架PLGA-HAp-ColⅠ，用以模仿關(guān)節(jié)內(nèi)從軟骨表面到軟骨下骨天然形成的各向異性的梯度結(jié)構(gòu)， 并對其相關(guān)結(jié)構(gòu)的特性和部分生物學(xué)的特征性進行測定，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗對象:新西蘭白兔1～2 只。

1.2 制備方法

1.2.1 采用溶液澆注- 瀝濾法制備雙相支架 取20 gPLGA溶解于50 mL 丙酮， 將分篩NaCl 晶體為粒徑100～300 μm，以質(zhì)量比為15∶85-加入PLGA 的丙酮溶液中，充分攪拌使NaCl 分散均勻，形成糊狀的混合物；將其置入模具中，靜置約20 min，混合物表面流平后，稍加擠壓成型，即為雙相支架的軟骨相， 厚度約1 mm。 另取PLGA 和HAp以質(zhì)量比1∶1 混合溶于丙酮， 同法分篩粒徑為300～500 μm 的NaCl 晶體造孔，充分攪拌均勻，形成的糊狀物再次倒入上述模具內(nèi)軟骨相的上部，制成骨相，控制厚度約2 mm，靜置待混合物表面流平，自然干燥2 d 使溶劑完全揮發(fā)。 置入AgNO3溶液除盡NaCl，期間每4～6 h 換液1 次，直至用硝酸銀溶液檢測不到置換出的水中有氯離子為止。 最后置入真空干燥箱中30℃干燥1～2 d，干燥至恒重。以將模型支架修整成直徑為4 mm 厚度為3 mm 的圓柱體結(jié)構(gòu)備用。 以豬皮為原料采用稀酸萃取法制得可溶性膠凍狀ColⅠ， 將其均勻涂于已經(jīng)制備好的雙相支架表面，即形成PLGA-HAp-ColⅠ雙相支架。

1.2.2 雙相支架與BMSCs 相容性 將P3 代兔BMSCs 細胞轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor 基因后，收集細胞懸液，以含10%FBS 的L-DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度約為1×106細胞/mL。 采用懸滴法滴加在支架表面，培養(yǎng)7 d 后，光鏡下觀察細胞在雙相支架的分布情況。

2 結(jié)果

經(jīng)液體置換法，測得制備的PLGA-HAp-ColⅠ雙相支架孔隙率為（82.09±4.0）%，復(fù)合實驗要求。 將種植基因修飾的BMSCs 支架進行石蠟切片， 應(yīng)用HE 染色后在光鏡下觀察可見：大量的細胞在支架上廣泛貼附，沿著支架的孔道結(jié)構(gòu)呈導(dǎo)向排列， 上層軟骨相內(nèi)可見圓形或橢圓形細胞貼附，胞質(zhì)被染成紅色，胞核為藍色，下次骨相內(nèi)可見圓形或多角形細胞貼附。 電鏡掃描可見支架表面空隙內(nèi)貼附并且聚集了大量的球形或者是多角形的細胞，由此可證實支架與BMSCs 具有良好的相容性。

3 討論

3.1 組織工程支架的材料

細胞生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有極其重要的地位，而隨著生物材料科學(xué)不斷地發(fā)展，組織工程學(xué)方法修復(fù)軟骨缺損是骨科研究中一種全新的治療模式， 骨組織工程中將種子細胞與支架材料相復(fù)合的研究是當(dāng)今的研究熱點,這一全新的治療方案將成為解決臨床上各種原因造成的骨組織缺損的最有效途徑之一[2-3]。 關(guān)于支架材料方面目前已經(jīng)有眾多的研究，其中PLGA 是人工合成可降解的高分子材料，應(yīng)用較為廣泛，因其支撐強度足夠，對細胞貼附生長起到促進作用，且生物相容性良好，無細胞毒性，所依可作為細胞載體應(yīng)用于組織工程中，是理想的軟骨組織工程支架材料。

羥基磷灰石（HAp）是目前應(yīng)用和研究最廣泛的支架材料之一，具有良好的生物相容性、生物活性、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，是公認性能良好的骨修復(fù)支架材料，廣泛用于骨組織工程修復(fù)中。 但是，HAp 也有其不足之處，在力學(xué)方面表現(xiàn)為脆性大和韌性差， 易發(fā)生折斷或碎裂等情況。 近些年的研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[4]，將HAp 與PLLA 結(jié)合制備成復(fù)合納米纖維支架后， 對PLLA 降解所導(dǎo)致的PH值變化可以緩沖，減少組織的炎性反應(yīng)，并且增加支架對蛋白的吸附能力。 因HAp 具備骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)的良好特性，所以在軟骨下骨層中加入HAp，結(jié)合BMSCs 能在缺損部位再生出軟骨下骨組織，且生物學(xué)性能良好。

Ⅰ型膠原來源廣泛、容易獲得、免疫源性低，所有的Ⅰ型膠原能自然的溶解于稀酸和稀堿中， 加熱到40℃以上后膠原蛋白可變性成單α-鏈。同時，Ⅰ型膠原生物安全性及生物相容性好、可降解吸收、帶有較多功能基因、利于改性、便于加工成多種形狀，常作為細胞培養(yǎng)的支架材料。 缺點是降解速率過快，機械強度不足，材料質(zhì)量批次間差別較大，獲得高純度的膠原費用高[5]。 盡管如此，但是Ⅰ型膠原還在很多組織工程研究中表現(xiàn)出良好的生物相容性，是可以作為或部分作為組織工程中的支架材料的。

3.2 組織工程中雙相支架應(yīng)用

軟骨下骨是維持軟骨結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基礎(chǔ)， 是軟骨修復(fù)的關(guān)鍵因素，在軟骨下骨發(fā)生病變的狀態(tài)下，新生的軟骨與其整合較難，故影響軟骨的修復(fù)。 雙相組織工程支架是新出現(xiàn)的一種新型支架， 較單相支架在力學(xué)方面表現(xiàn)出更好的特性，綜合了兩種或兩種以上材料的優(yōu)點，可以在兩層不同的支架內(nèi)分別種植不同的細胞， 這是同時修復(fù)軟骨和軟骨下骨的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 軟骨細胞與成骨細胞在共同培養(yǎng)時，二者可以相互促進，利于植入的支架與周圍的組織更好地融合。

實驗中我們制備的PLGA-HAp-ColⅠ雙相支架，由于PLGA 是支架的主體， 兩層支架均由PLGA 材料構(gòu)成，軟骨相為PLGA，骨相為PLGA 與HAp 混合物，支架外為ColⅠ涂層，因而不存在材料之間結(jié)合不良的現(xiàn)象。 而且制備雙相支架時使用溶液澆注-瀝濾法，制備、交聯(lián)過程中并未導(dǎo)致其內(nèi)部的化學(xué)架構(gòu)產(chǎn)生變化， 符合了天然骨軟骨界面的化學(xué)構(gòu)成。 因此，在阻止關(guān)節(jié)運動的過程中，發(fā)生軟骨層與軟骨下骨層分離的同時， 還能促使兩層支架的緊密結(jié)合，避免了發(fā)生分離和開裂的現(xiàn)象。 在支架軟骨相中含有PLGA 和ColⅠ，空間結(jié)構(gòu)足夠，生物相容性良好，對種子細胞的增殖和粘附非常適合。支架軟骨下骨相中包含HAp、PLGA 和ColⅠ成分，是較好的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)的生物活性材料。 該實驗制備的雙相支架具有明顯的骨相與軟骨相以及穩(wěn)定的界面結(jié)構(gòu)， 并沒有在制備過程中發(fā)生分層或斷裂現(xiàn)象。 實驗結(jié)果測得，制備的PLGA-HAp-ColⅠ雙相支架其孔隙率為（82.09±4.0）%，這和吳思宇[6]等的研究結(jié)果基本一致， 他們在實驗中制備的多孔支架孔隙率為（91.6±0.3）%。 組織工程的支架中孔徑和孔隙率是極為重要的參數(shù)，能夠?qū)χЪ艿牧W(xué)性能、生物相容性和降解時間等產(chǎn)生諸多影響。 在實驗中發(fā)現(xiàn)的孔隙率越低，則代表支架的機械性能越高； 而孔隙率越高會越利于受損部位的骨髓細胞遷移進入，從而修復(fù)骨軟骨的缺損。

3.3 雙相支架的各項特性

生物相容性：實驗中制備出的雙相支架，其中PLGA、HAp 及ColⅠ成分在諸多實驗中已經(jīng)被證實生物相容性良好。 在對制備好的支架進行生物相容性的測定時發(fā)現(xiàn)：石蠟切片實驗和后面的電鏡掃描結(jié)果均發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)過基因修飾的BMSCs 在支架上可以廣泛且大量的粘附， 并進行增殖，由此足以證明實驗中制備的雙相支架，生物相容性良好，適合作為組織工程中的細胞載體。

孔徑和孔隙率：組織工程的支架中，孔徑和孔隙率是兩項重要的參數(shù)，對支架的生物相容性、力學(xué)性能、降解時間等影響力較大。支架的孔隙架構(gòu)能夠決定細胞生長的微環(huán)境以及啟動組織再生的過程，孔間連通性、孔隙的微觀形態(tài)、孔徑大小和孔隙率等因素均能對細胞的粘附、增殖等生物活性產(chǎn)生影響[7]。 該次實驗制備的PLGA-HAp-ColⅠ雙相支架，其上層軟骨相和下層骨相緊密結(jié)合，具有良好的孔隙率，且兩層結(jié)構(gòu)性能不同，可以很好的模擬出包括軟骨層、 鈣化軟骨層及軟骨下骨層的全層軟骨結(jié)構(gòu)層次，對促進新生組織的形成作用優(yōu)良，更能完全有效地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨缺損。

降解時間： 支架的降解時間和良好的吸收性是支架生物相容性的一項重要參數(shù)， 直接影響支架理化性能和修復(fù)效果。 最理想的支架降解時間就是能夠與再生出新生組織的時間良好銜接， 在早期可以為缺損區(qū)的新生組織提供附著和支撐， 而在新生組織完全形成的時候就基本降解完全，避免影響新生組織的再生[8]。 研究前期活體內(nèi)的降解實驗中我們發(fā)現(xiàn)， 制備的支架沒有任何的組織毒性，也無誘發(fā)機體異物炎癥的反應(yīng)，且能與周圍組織進行良好相容，能夠在體內(nèi)逐漸降解，降解速度能滿足關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨再生要求。

4 結(jié)論

在實驗中制備出的PLGA-HAp-ColⅠ雙相支架，制備方法簡單，且兩層支架之間結(jié)合緊密，可模擬骨軟骨界面的組織特性。 支架具備空間導(dǎo)向控制細胞分布的能力，與轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor 后的BMSCs 的生物相容性良好，有利于基因修飾的BMSCs 吸附、增殖。 由此可見，PLGAHAp-ColⅠ雙相支架具備修復(fù)和重建骨軟骨缺損的特性，接種基因修飾的BMSCs 后修復(fù)效果更佳。