過敏性鼻炎中Th9 細(xì)胞亞群的研究進(jìn)展

何瑋，梁興明，文芳芳

南寧市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣西南寧 530031

耳鼻喉科疾病中最為常見的類型包括變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，該疾病不威脅患者生命，但在一定程度上會(huì)對(duì)患者的生活及工作造成損害。近幾年AR 的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)發(fā)展， 以往多數(shù)學(xué)者指出，AR 作為過敏性反應(yīng)，Th2 細(xì)胞在其發(fā)生過程中有所參與， 而Th1 細(xì)胞在該過程中含量相對(duì)較低。 IL-4、IL-5 以及IL-13 由Th2細(xì)胞分泌后刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫球蛋白E，同時(shí)使機(jī)體的部分細(xì)胞產(chǎn)生浸潤(rùn)情況，例如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，上述情況持續(xù)發(fā)展后引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)一系列的炎性反應(yīng)[1]。 針對(duì)AR 的相關(guān)臨床特點(diǎn)， 機(jī)體內(nèi)存在的部分免疫機(jī)制中Th2 細(xì)胞存在一定的介導(dǎo)作用，而該類免疫機(jī)制可對(duì)以上臨床特點(diǎn)進(jìn)行解釋，然而解釋無(wú)法完整闡述AR 的免疫機(jī)制。Dimitri Poddighe[2]研究后表明，在部分過敏反應(yīng)中，Th2細(xì)胞應(yīng)答起到主導(dǎo)作用， 在該類過敏反應(yīng)引發(fā)的炎癥中加強(qiáng)Th1 細(xì)胞產(chǎn)生的炎性反應(yīng)，對(duì)癥狀表現(xiàn)無(wú)明顯影響，證實(shí)Th1/Th2 細(xì)胞水平失衡不是引發(fā)過敏性疾病的唯一病因。 最初IL-9 被指認(rèn)為是由肥大細(xì)胞、T 細(xì)胞等細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子， 具有多重功能， 屬于Th2 型細(xì)胞因子之一， 但最新研究指出其為新型T 輔助亞群， 被命名為“Th9”亞群，與Th2 細(xì)胞亞群存在一定差異，可分泌大量IL-9 并且具有免疫反應(yīng)特異性。該研究旨在綜合分析Th9細(xì)胞的生物學(xué)特征，并針對(duì)AR 中Th9 細(xì)胞的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)一步研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 Th9 細(xì)胞簡(jiǎn)介

李安等[3]學(xué)者在2008 年通過對(duì)不同輔助性T 細(xì)胞亞群產(chǎn)生的細(xì)胞因子進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)染色研究，結(jié)果顯示初始CD4+T 細(xì)胞在TGF-β、IL-4 存在的前提下被激活后，可使IL-9、IL-10 的含量明顯增加，其他Th2 細(xì)胞因子無(wú)明顯變化，證實(shí)Th2 細(xì)胞不是產(chǎn)生IL-9 的細(xì)胞。在該情況下產(chǎn)生IL-9 的細(xì)胞亞群與Th1、Th17、Treg 亞群均存在一定差異，該現(xiàn)象表明該亞群為一種新型輔助性T細(xì)胞亞群。 經(jīng)相關(guān)研究后，Th9 細(xì)胞的各種功能紛紛得到證實(shí)，具有大量增殖以及促進(jìn)T 細(xì)胞增殖反應(yīng)的特點(diǎn)。 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Th9 細(xì)胞中無(wú)T-bet、GATA3 等專一性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)， 更加證實(shí)Th9 細(xì)胞亞群為獨(dú)立于Th1、Th17 以及Treg 細(xì)胞以外的新型亞群，Th9 為明確各類疾病的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制奠定良好的理論基礎(chǔ)。

2 由Th9 細(xì)胞分化而來(lái)的轉(zhuǎn)錄因子

細(xì)胞亞群功能、 分化過程中特異性轉(zhuǎn)錄因子起到關(guān)鍵性作用。ETS 轉(zhuǎn)錄因子家族成員中的PU.1 經(jīng)抗原受體、TGF-β 共同刺激誘導(dǎo)后， 在Th9 細(xì)胞中相比于Th1、Th2、Th17 細(xì)胞表達(dá)水平明顯更高[4]。PU.1 與Il9 啟動(dòng)子結(jié)合后，使染色質(zhì)修飾酶大量聚集，以此達(dá)到重構(gòu)染色質(zhì)的目的，進(jìn)而促進(jìn)IL-9 基因的轉(zhuǎn)錄過程[5]。CD4+T 細(xì)胞在缺乏PU.1 條件下其生成IL-9 的速度明顯降低，PU.1 在TGF-β 存在情況下出現(xiàn)異位表達(dá)，加快Th2 轉(zhuǎn)化為Th9 的過程，同時(shí)增強(qiáng)Th9 表達(dá)水平，加快IL-9 的生成速度，但對(duì)Th1、Th17、Treg 中IL-9 的表達(dá)無(wú)明顯影響[6]。 由此可知，PU.1是現(xiàn)階段Th 細(xì)胞中唯一一類在生成IL-9 過程中具有誘導(dǎo)作用的轉(zhuǎn)錄因子。PU.1 基因是Th9 細(xì)胞中的特殊存在，該因子可在無(wú)IL-4- STAT6 信號(hào)誘導(dǎo)的情況下， 誘導(dǎo)下游的TGF-β 信號(hào)通道產(chǎn)生效果。給予Sfpi1 基因在Th9 細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件， 結(jié)果顯示基因中未出現(xiàn)PU.1 編碼差異表達(dá)的情況， 以上結(jié)果表明， 非依賴信號(hào)機(jī)制中的SMAD 在TGF-β 誘導(dǎo)下可調(diào)節(jié)PU.1 表達(dá)。 Th9 分化過程中具有中地位的轉(zhuǎn)錄因子為干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulatory factor 4，IRF4)，T 細(xì) 胞 存 在IRF4 缺 陷 導(dǎo) 致Th9發(fā)育出現(xiàn)異常。 李曉燕[7]研究發(fā)現(xiàn)存在IRF4 缺陷的小鼠中的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)強(qiáng)度處于較低水平， 相比于正常小鼠降低幅度非常明顯，IRF4 缺乏可能是導(dǎo)致該現(xiàn)象的主要原因， 機(jī)制是該因子含量相對(duì)缺乏后在一定程度上影響Th2、Th17、Th9 細(xì)胞發(fā)育，進(jìn)而影響變應(yīng)性反應(yīng)。

IRF4 可以與或BATF 屬于活化蛋白(activator protein，AP)1 家族轉(zhuǎn)錄因子之一，其與P U.1、IRF4 可在DNA 水平上達(dá)到整合。 Th9 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程中IRF4、BATF 起到共同誘導(dǎo)作用。 Th9 細(xì)胞經(jīng)IL1β 刺激后其會(huì)存在Th1 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子IRF1 表達(dá)的現(xiàn)象， 該因子可與il9、il21 啟動(dòng)子直接結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)以上兩種因子大量分泌。 現(xiàn)階段尚未明確IRF1 在Th9 的極化過程中是單獨(dú)參與還是聯(lián)合其他轉(zhuǎn)錄因子共同作用。 另外，在Th9 細(xì)胞的分化過程中存在一定參與的STAT6 以及GATA3 兩類轉(zhuǎn)錄因子， 可在Th2 細(xì)胞上表達(dá)。在IL4R 信號(hào)參與的前提下，STAT6 磷酸化后在Th9 細(xì)胞的分化過程中進(jìn)行一定程度的參與并發(fā)揮重要作用。而PARP-14 作為STAT6 的輔助因子，對(duì)Th2細(xì)胞的發(fā)育過程及IL-9 的產(chǎn)生過程均具有一定程度的影響。 而作為Th2 發(fā)育過程中具有重要作用的因子STAT3，相比于STAT6 在Th9 發(fā)育過程中可被激活， 但并無(wú)明顯影響。

STAT 6 磷酸化后誘導(dǎo)GATA3 表達(dá)，Th9 細(xì)胞分化過程中GATA3、STAT 6 存在重要作用。 宋敏[8]研究發(fā)現(xiàn)小鼠存在STAT6 缺陷、GATA3 缺陷時(shí)無(wú)Th9 細(xì)胞生成，該現(xiàn)象證實(shí)以上觀點(diǎn)。 但某研究數(shù)據(jù)顯示，IL-9 基因的轉(zhuǎn)錄過程中GATA3 并未直接參與調(diào)控， 而是通過下調(diào)Foxp3 對(duì)Th9 發(fā)育產(chǎn)生間接影響。

3 IL-9

最初IL-9 克隆稱為“P40”，對(duì)T 細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)效果，TCGFIII 屬于T 細(xì)胞生長(zhǎng)因子之一， 被指出與P40 結(jié)構(gòu)完全一致。 將以上兩種物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行研究，獲得數(shù)據(jù)顯示，CD4+T 細(xì)胞在產(chǎn)生TCGFIII 的同時(shí)， 可產(chǎn)生定量的MEA 因子，該因子在一定程度上可提升肥大細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。 經(jīng)研究證實(shí)P40、TCGFIII、MEA 為同一種細(xì)胞因子，最終統(tǒng)一命名為IL-9[9]。

Il 9 基因編碼蛋白由144 個(gè)氨基酸組成，其中含有14 kD 的糖蛋白以及18 個(gè)典型氨基酸信號(hào)肽。從核酸水平角度分析，人和鼠的IL-9 同源性接近70%，而從蛋白水平分析其同源性為55%。 在人類身體中IL-9 基因的主要位置為Th2 細(xì)胞因子基因簇， 該基因簇位于第5 號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，而該基因在鼠類中的主要分布位置為第13 號(hào)染色體上，基因構(gòu)成極為相似，長(zhǎng)度為4 kb，含有外顯子、內(nèi)含子的數(shù)量分別為5 個(gè)、4 個(gè)[10]。 激活蛋白AP-1 與AP-2 轉(zhuǎn)錄因子特異性的結(jié)合序列，在人、鼠體內(nèi)是IL-9 基因的啟動(dòng)子區(qū)域。 另外，該區(qū)域中的某結(jié)合區(qū)域?qū)９㊣FN 調(diào)節(jié)因子1 結(jié)合，該區(qū)域位于5’端位置。 對(duì)IL-9 分別在T 細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞中的產(chǎn)生水平進(jìn)行分析，獲得數(shù)據(jù)顯示IL-9 分泌含量與IL-1 的上調(diào)有關(guān)。 以骨髓單核細(xì)胞進(jìn)行深層次的探索研究，結(jié)果顯示IL-10、LPS、Kit 配體是除IL-1外對(duì)IL-9 產(chǎn)生過程具有協(xié)調(diào)作用的因子。 GATA-1 在骨髓單核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-9 轉(zhuǎn)錄過程中具有關(guān)鍵作用。在IL-4、TGF-β 的協(xié)同刺激下CD4+T 細(xì)胞中對(duì)IL-2 依賴性增強(qiáng)，進(jìn)而加快IL-9 的生成，該過程中IL-9 生成水平因IFN-γ 抑制受到一定限制。 綜合以上研究數(shù)據(jù)分析，IL-9 的生成來(lái)源較多， 例如T 細(xì)胞亞群中的多種Th2 細(xì)胞。 現(xiàn)有的研究文獻(xiàn)中，部分學(xué)者受到當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件限制，未能獲得足夠的抗IL-9 抗體進(jìn)行研究，進(jìn)而使IL-9/IL-4 雙陽(yáng)細(xì)胞在人體內(nèi)的水平等相關(guān)延伸研究未能順利施展， 造成其未能明確Th2 細(xì)胞在分泌IL-4 的同時(shí)是否是產(chǎn)生IL-9 的主要來(lái)源， 也未能針對(duì)其它特定T 細(xì)胞亞群中IL-9 的分泌量進(jìn)行研究。

Trakaki Athina[11]進(jìn)行同方向研究后，指出IL-4、TGFβ 在CD4+T 細(xì)胞亞群中， 屬于主要的生長(zhǎng)因子及分化因子，促進(jìn)IL-9 大量產(chǎn)生，因此以Th9 細(xì)胞亞群為該亞群進(jìn)行命名。測(cè)定IL-9、IL-4 特異性單克隆抗體在該菌群中的水平時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行，獲得結(jié)果表明，分泌IL-4的部分殘存在Th9 細(xì)胞群中的細(xì)胞中， 未檢測(cè)到IL-9 分泌， 該細(xì)胞菌群中也未檢測(cè)出IL-4、IL-9 雙陽(yáng)細(xì)胞存在。經(jīng)某項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，IL-9 在Th2 細(xì)胞上清液中存在， 證實(shí)Th9 樣細(xì)胞是IL-9 的來(lái)源之一， 與Th2 細(xì)胞中分泌IL-4的細(xì)胞無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。

作為T 細(xì)胞生長(zhǎng)因子的IL-9， 可直接對(duì)B 細(xì)胞產(chǎn)生作用效果， 在一定程度上對(duì)炎癥細(xì)胞及正常組織細(xì)胞產(chǎn)生影響，同時(shí)使嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增加，進(jìn)而對(duì)Ig E 的分泌水平起到促進(jìn)效果，使肥大細(xì)胞對(duì)過敏原的反應(yīng)強(qiáng)烈程度增加， 提升黏蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)刺激炎性細(xì)胞因子的分泌。

4 AR 患者中的Th9 水平

IL-9 在AR 患者血清中的水平與其鼻癢、 打噴嚏、長(zhǎng)時(shí)間流等癥狀的嚴(yán)重程度呈顯著正向相關(guān)， 與鼻塞存在較弱的負(fù)向相關(guān)[12]。 AR 患者在變應(yīng)原免疫治療前后，其IL-9 陽(yáng)性細(xì)胞、 嗜酸粒細(xì)胞在鼻黏膜中的數(shù)量存在顯著相關(guān)性， 免疫治療持續(xù)2 年后，IL-9 蛋白、mRNA 的水平均出現(xiàn)明顯降低。

采用離體過敏原對(duì)哮喘、AR 等特應(yīng)性個(gè)體患者進(jìn)行刺激，刺激的主要對(duì)象為體內(nèi)的外周血單個(gè)核細(xì)胞，刺激后獲得的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)顯示，IgE 特異性過敏原與IL-9 水平二者間具有明顯的相關(guān)性， 其特異性強(qiáng)度遠(yuǎn)高于IL-13、IL-5 等其他因子， 哮喘患者體內(nèi)的IL-9 水平相比于AR 患者明顯更高。

刺激AR 患者的過敏原，檢測(cè)患者的鼻黏膜組織中各類因子水平，數(shù)據(jù)顯示，IL-9 陽(yáng)性細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞局出現(xiàn)含量上升的情況， 另外人鈣激活氯離子通道Ⅰ型在檢測(cè)組織中的表達(dá)水平相應(yīng)增加， 但T 細(xì)胞數(shù)量在組織中的含量未檢測(cè)到明顯變化。

胡曉春[13]在構(gòu)建AR 小鼠模型的過程中，選取的基礎(chǔ)為卵清蛋白致敏，對(duì)成功構(gòu)建的小鼠模型進(jìn)行檢測(cè)，方法為免疫組織化學(xué)SABC 法，鼻黏膜上皮細(xì)胞、黏膜下層腺體細(xì)胞的胞漿內(nèi)部、 固有層炎性細(xì)胞均是IL-9 免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)的主要位置， 該因子表達(dá)水平在末次激發(fā)呈時(shí)間效應(yīng)關(guān)系， 隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)先增后降的水平變化。 AR鼠模型經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測(cè)定， 測(cè)定的位置為鼻黏膜組織檢測(cè)目標(biāo)為轉(zhuǎn)錄因子PU.1 mRNA、IL-9 的含量變化， 該過程中對(duì)小鼠鼻黏膜組織中的IL-9 蛋白表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定，方法選用流式微球術(shù)，數(shù)據(jù)顯示IL-9 mRNA/蛋白、 轉(zhuǎn)錄因子PU.1 mRNA 在AR 鼠鼻黏膜組織中均呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平。 IL-9 mRNA 在鼻黏膜組織中的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄因子PU.1 mRNA 表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。 在AR 鼠模型基礎(chǔ)上使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Th9 細(xì)胞在鼻黏膜中高水平表達(dá)。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著Th9 細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)，使研究AR 疾病的治療找到新方向。 Th9、IL-9、PU.1 均在AR 疾病的發(fā)展過程中有所參與并發(fā)揮重要作用，但具體作用機(jī)制尚未明確。 可將特異性中IL-9 抗體、 敲除PU.1 基因等作為研究切入點(diǎn)，進(jìn)一步探究以上因子在AR 中的作用機(jī)制進(jìn)行研究，Th9與AR 的具體聯(lián)系， 可根據(jù)上述因子與免疫成分Th17、Treg 等之間的相互關(guān)系進(jìn)一步確定。