淋巴細(xì)胞活化基因3在惡性腫瘤中的意義及研究進(jìn)展

高峰，劉子玲

吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心腫瘤科，長(zhǎng)春 130021

人們對(duì)惡性腫瘤免疫治療的探索可以追溯到一百多年前，但由于腫瘤的異質(zhì)性、免疫系統(tǒng)及腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性及腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力等，惡性腫瘤的免疫治療直到近年來(lái)才有了突破性進(jìn)展[1]。免疫檢查點(diǎn)是一系列共抑制配/受體通路參與維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)、自身免疫耐受與抗腫瘤作用之間的平衡，因?yàn)樗鼈兤胶饬斯泊碳ば盘?hào)并防止了過(guò)度的免疫反應(yīng)。腫瘤可以利用免疫檢查點(diǎn)通路實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，尤其是逃避針對(duì)腫瘤特異性抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)[2]。抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）呈遞的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（peptide-major histocompatibility complex，pMHC）能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，但免疫檢查點(diǎn)通路發(fā)出的負(fù)性信號(hào)不僅會(huì)減弱T細(xì)胞活化，還會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞的功能失活，導(dǎo)致無(wú)反應(yīng)和耐受狀態(tài)[3-4]。于是免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）療法應(yīng)運(yùn)而生。隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）取得重大進(jìn)展并逐步應(yīng)用于臨床，不同機(jī)制、不同環(huán)節(jié)的免疫靶點(diǎn)也相繼被挖掘。作為最受關(guān)注的新興免疫靶點(diǎn)之一，淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG3）已經(jīng)初顯應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。本文就LAG3的生物學(xué)特性及其在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 LAG 3的生物學(xué)特性

1.1 LAG 3的結(jié)構(gòu)

LAG3（CD223）是一種由498個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）成員，對(duì)T細(xì)胞的功能有多種生物學(xué)影響[5]。成熟的LAG3包括4個(gè)部分：疏水前導(dǎo)區(qū)、細(xì)胞外區(qū)域、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，其中細(xì)胞外區(qū)域由4個(gè)免疫球蛋白超家族樣結(jié)構(gòu)域（D1～D4）組成，與CD4高度同源，但其與MHCⅡ類分子的親和力較CD4高約100倍[6]。LAG3獨(dú)特的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域具有絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、KIEELE序列和谷氨酸脯氨酸重復(fù)序列3個(gè)部分，其中KIEELE序列對(duì)LAG3發(fā)揮抑制功能具有關(guān)鍵作用，已被證明是LAG3下調(diào)T細(xì)胞功能的必需成分[7-8]。但是，LAG3發(fā)揮作用的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍不清楚[6,9]。LAG3早期被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于活化的T細(xì)胞（主要是CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和部分γδT細(xì)胞）和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞，后來(lái)證實(shí)LAG3也在B細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）上表達(dá)[7,10-11]。LAG3的表達(dá)及其與MHCⅡ類分子的親和力在炎性條件下顯著上調(diào)，部分炎性因子如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2、IL-7和IL-12等可以提高活化T細(xì)胞上LAG3的表達(dá)水平[10]。并且，LAG3的結(jié)合能力通常與MHCⅡ類分子的表達(dá)水平相關(guān)[12]。

1.2 LAG 3的配體

MHCⅡ類分子是最早被發(fā)現(xiàn)的LAG3配體。LAG3以較高的親和力與MHCⅡ類分子結(jié)合，二者相互作用可下調(diào)腫瘤浸潤(rùn)性CD4+T細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞因子的分泌，且該過(guò)程中伴有LAG3的上調(diào)[10]。除了MHCⅡ類分子以外，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中的半乳糖凝集素-3（Galectin-3）和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞凝集素（liver sinusoidal endothelial cell lectin，LSECtin）也被證實(shí)是LAG3的配體[9]。Galectin-3是一種可溶性凝集素，通過(guò)LAG3途徑抑制CD8+T細(xì)胞的功能并抑制pDC的增殖，從而抵抗機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，可在多種細(xì)胞類型（包括腫瘤細(xì)胞）中廣泛表達(dá)[4]。因此，Galectin-3與LAG3的相互作用可增強(qiáng)其對(duì)TME中腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[13]。LSECtin在肝臟和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，LSECtin/LAG3通過(guò)抑制抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞中γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的分泌以減弱抗腫瘤免疫反應(yīng)，采用抗LAG3抗體進(jìn)行阻斷后可逆轉(zhuǎn)LSECtin介導(dǎo)的IFN-γ分泌減少[14]。Wang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原樣蛋白1（fibrinogen like 1，F(xiàn)GL1）是獨(dú)立于MHCⅡ類分子的主要的LAG3功能配體。FGL1能夠抑制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞活化，單克隆抗體對(duì)FGL1/LAG3的阻斷可增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者血漿中高水平的FGL1與預(yù)后不良以及對(duì)程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱 PD-1）/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）抑制劑治療的耐藥性相關(guān)，這對(duì)于腫瘤免疫治療的發(fā)展意義重大。另有研究發(fā)現(xiàn)，病理性α-突觸核蛋白原纖維也可以與LAG3結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，病理性α-突觸核蛋白原纖維在神經(jīng)元之間的傳遞通過(guò)LAG3與神經(jīng)元的結(jié)合來(lái)完成，由于錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白原纖維在細(xì)胞間傳遞可能是帕金森病的一種發(fā)生機(jī)制，LAG3阻斷或許能夠使帕金森病的治療獲得令人驚喜的效果[16]?？傊壳耙寻l(fā)現(xiàn)LAG3具有多個(gè)配體，可能還有其他配體尚未被發(fā)現(xiàn)，有待于繼續(xù)探索并確定是否為有效配體及其與LAG3相互作用的時(shí)間和機(jī)制，這對(duì)LAG3的后續(xù)研究至關(guān)重要。

2 LAG 3的免疫抑制作用

早期研究已經(jīng)明確LAG3具有免疫抑制作用，能夠負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，LAG3缺乏或?qū)AG3進(jìn)行阻斷可促進(jìn)T細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[5]。如前所述，LAG3在CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Treg、NK細(xì)胞及pDC上均可表達(dá)。但LAG3與NK細(xì)胞間的作用機(jī)制尚不明確[9-12]。有研究表明，IL-12能夠誘導(dǎo)NK細(xì)胞中LAG3的表達(dá)[17]。LAG3發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制如下：①通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)作用直接抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化、增殖及功能，并參與T細(xì)胞“耗竭”和維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[5,18-19]；②增強(qiáng)免疫抑制細(xì)胞Treg的抑制活性[6,18]；③在腫瘤部位的LAG3介導(dǎo)pDC的激活，而后者可以引導(dǎo)免疫耐受[20-21]。

2.1 LAG 3影響免疫穩(wěn)態(tài)

淋巴細(xì)胞尤其是T細(xì)胞的數(shù)量對(duì)免疫穩(wěn)態(tài)的維持具有關(guān)鍵作用。T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡受嚴(yán)格調(diào)控，產(chǎn)生的細(xì)胞池需要滿足兩個(gè)條件，既能對(duì)抗外來(lái)抗原又可防止自身發(fā)生過(guò)度免疫[18]。在外周，T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至少受T細(xì)胞抗原受體（T lymphocyte antigen receptor，TCR）、γ鏈細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及Treg的抑制活性3個(gè)方面調(diào)控[18]。LAG3在Treg上組成性表達(dá)并可促進(jìn)其分化，這有助于后者發(fā)揮免疫抑制作用，而LAG3阻斷可減弱Treg的功能[9,18]。FOXP3+Treg是維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑[22]。IL-27兼具促炎和抗炎功能，可以通過(guò)增強(qiáng)Treg的功能控制某些自身免疫病。研究顯示，IL-27能夠誘導(dǎo)Treg表達(dá)LAG3[22]。這些研究從另一方面說(shuō)明了LAG3通過(guò)Treg影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)。此外，CD4+T細(xì)胞上LAG3的表達(dá)與γ鏈細(xì)胞因子（如IL-2、IL-7、IL-12和 IFN-γ）有關(guān)[18]。因此，LAG3破壞了CD4+T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，并且腫瘤浸潤(rùn)的LAG3+Treg可產(chǎn)生大量的免疫抑制分子IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）[4]。

2.2 LAG 3與pDC的相互作用

pDC是可以產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的獨(dú)特子集，也可以誘導(dǎo)耐受性免疫應(yīng)答。靜息狀態(tài)下pDC上的LAG3mRNA較T細(xì)胞增加約70倍，但LAG3在任何髓樣或淋巴樣DC子集上均不表達(dá)[5]。pDC富集到腫瘤部位通常與預(yù)后不良有關(guān)，因?yàn)槟[瘤浸潤(rùn)性的pDC趨向于致耐受性而非免疫性[20]。有研究證實(shí)了腫瘤部位存在LAG3介導(dǎo)的pDC激活，并且在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，MHCⅡ類分子/LAG3的相互作用和所導(dǎo)致的pDC激活可能會(huì)隨著惡性腫瘤的進(jìn)展而增加[21]。

2.3 LAG 3對(duì) T細(xì)胞的調(diào)節(jié)

Maruhashi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LAG3并非直接與CD4競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合MHCⅡ類分子，而是通過(guò)構(gòu)象依賴性選擇性地識(shí)別穩(wěn)定的抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物（pMHCⅡ），進(jìn)而抑制CD4+T細(xì)胞的增殖與活化，這種高度選擇性有助于其維持自身免疫耐受。值得注意的是，腫瘤浸潤(rùn)性CD4+T細(xì)胞上LAG3的表達(dá)水平會(huì)隨著腫瘤的進(jìn)展而上調(diào)[10]。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，LAG3調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的方式是調(diào)控后者的代謝水平，LAG3缺乏后通過(guò)提高線粒體生物發(fā)生（即在細(xì)胞中形成新線粒體的過(guò)程[23]）的水平來(lái)增強(qiáng)初始CD4+T細(xì)胞的代謝活動(dòng)。LAG3阻斷后可將部分野生型CD4+T細(xì)胞的增殖和代謝表型恢復(fù)至LAG3-/-CD4+T細(xì)胞的水平，這揭示了LAG3調(diào)控CD4+T細(xì)胞的另一途徑[24]。

在慢性炎癥環(huán)境中（如腫瘤或慢性感染性疾?。掷m(xù)性的抗原暴露和T細(xì)胞活化會(huì)導(dǎo)致LAG3在T細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)，并常與其他免疫抑制性受體如PD-1、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucin protein-3，TIM-3）、含Ig及ITIM結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞免疫受體（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）等共表達(dá)，導(dǎo)致T細(xì)胞免疫功能異常[25]。并且，在慢性病毒性感染和惡性腫瘤中，包括LAG3在內(nèi)的多個(gè)共抑制受體在“疲憊”的CD8+T細(xì)胞上均呈高表達(dá)[4,26]。“疲憊”的CD8+T細(xì)胞存在功能障礙，細(xì)胞因子產(chǎn)生減少[5]。盡管這些共抑制受體有利于腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和逃逸，但是對(duì)于機(jī)體正常的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)是必不可少的。體外自身免疫模型中的研究驗(yàn)證了LAG3缺乏或功能缺陷會(huì)導(dǎo)致無(wú)法維持正常的免疫耐受[5]。并且同類型的研究發(fā)現(xiàn)，LAG3-/-PD-1-/-型小鼠死于致命的全身免疫，表明了LAG3和PD-1在維持免疫穩(wěn)態(tài)和預(yù)防自身免疫病方面具有協(xié)同作用[5,27-28]。這也是ICB療法不良反應(yīng)的一個(gè)重要方面。在慢性感染性疾病模型中，LAG3的表達(dá)與感染的嚴(yán)重程度直接相關(guān)，并且其在病毒特異性CD8+T細(xì)胞和寄生蟲特異性CD4+T細(xì)胞上均與PD-1共表達(dá)，LAG3/PD-1協(xié)同阻斷可在一定程度上逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞的“耗竭”[23]，改善CD8+和CD4+T細(xì)胞的免疫功能[29-30]。

臨床前研究顯示，LAG3阻斷增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞的功能，并引起較高水平的IFN-γ產(chǎn)生[18]。已有多項(xiàng)研究表明，LAG3在各種惡性腫瘤（如卵巢癌、肝細(xì)胞癌、腎癌等）的腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[18-19]。Galectin-3和LSECtin主要與LAG3相互作用來(lái)調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的活化與功能[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，多種人類和小鼠腫瘤模型中腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）上的LAG3與PD-1共表達(dá)[27,31-32]，二者具有協(xié)同作用，LAG3與PD-1協(xié)同阻斷改善了CD4+和CD8+TIL的反應(yīng)[23]，這表明抗LAG3抗體聯(lián)合PD-1/程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）可以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，也為后續(xù)的LAG3抑制劑與其他ICI聯(lián)合應(yīng)用的臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)[22,33-34]。雖然目前對(duì)于不同的抑制性受體介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制尚不完全清楚，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，與單一ICB相比，雙重阻斷在體外和體內(nèi)均可增強(qiáng)腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞的功能[26]?？偠灾?，LAG3是T細(xì)胞“耗竭”的重要參與者，作為繼PD-1/PD-L1/CTLA4之后的又一關(guān)鍵靶點(diǎn)，其對(duì)于惡性腫瘤的臨床治療具有重要意義。

3 LAG 3在惡性腫瘤免疫治療中的臨床研究

ICI在惡性腫瘤免疫治療中取得了巨大的成就，尤以PD-1/PD-L1/CTLA4的抑制劑效果最為顯著。然而隨著ICI越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于臨床，其存在的問(wèn)題和局限性也日益凸顯，例如ICI的總體反應(yīng)率較低、原發(fā)或獲得性耐藥以及ICI導(dǎo)致的免疫相關(guān)不良反應(yīng)等。除了解決這些問(wèn)題，許多研究者也開(kāi)始尋求新的思路，將探索方向?qū)?zhǔn)新興的免疫治療靶點(diǎn)LAG3，同時(shí)多種治療方法組合的模式如ICI聯(lián)合嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）、分子靶向治療或雙重ICB等也顯現(xiàn)出一定的臨床獲益。

有研究顯示，人血清中可溶性LAG3（soluble LAG3，sLAG3）的水平代表細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的激活水平，IMP321是sLAG3二聚體的重組形式，是臨床研發(fā)的一種APC激活劑，通過(guò)MHCⅡ類分子刺激APC以及被APC刺激的次級(jí)靶細(xì)胞（如記憶T細(xì)胞）可以誘導(dǎo)持續(xù)的免疫反應(yīng)，這種方式不同于抗LAG3抗體對(duì)LAG3/MHCⅡ類分子相互作用的阻斷[35]。IMP321已經(jīng)在腎細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌和黑色素瘤中進(jìn)行了初期臨床試驗(yàn)，但僅在小部分患者中觀察到有限的成效[8]。最近一項(xiàng)旨在評(píng)估紫杉醇+IMP321對(duì)比紫杉醇+安慰劑治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的研究AIPAC（NCT02614833）正在進(jìn)行中[35]。此外還有多項(xiàng)將IMP321用于原位免疫（如腫瘤疫苗）的臨床試驗(yàn)（如NCT01308294、NCT00365937、NCT00324623）以及將IMP321聯(lián)合其他ICI治療惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)（如NCT02676869、NCT03625323）均已啟動(dòng)。

Relatlimab（BMS-986016）是目前開(kāi)展臨床試驗(yàn)較多的抗LAG3單克隆抗體，在PD-1/PD-L1治療后進(jìn)展的黑色素瘤人群中表現(xiàn)出了良好的效果（NCT01968109）[36]。此外還有十余項(xiàng)Relatimab聯(lián)合其他ICI的研究開(kāi)始招募患者或正在進(jìn)行中。LAG525是另一種人源化抗LAG3單克隆抗體。LAG525的第一項(xiàng)臨床試驗(yàn)是研究LAG525+PDR001（Spartalizumab，抗PD-1單克隆抗體）治療晚期惡性腫瘤的療效（NCT02460224）。正在進(jìn)行中的還有LAG525+PDR001用于晚期實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤的Ⅱ期臨床研究（NCT03365791）[37]。LAG3單克隆抗體MK-4280單獨(dú)給藥或聯(lián)合派姆單抗（Pembrolizumab）針對(duì)晚期實(shí)體瘤的臨床研究（MK-4280-001）預(yù)計(jì)共納入340例患者，目前也正在招募（NCT02720068）[38]。其他的 LAG3抑制劑如 REGN3767[39]、TSR-033[40]和 Sym022[41]也已陸續(xù)開(kāi)展相關(guān)臨床試驗(yàn)。值得一提的是，目前已經(jīng)研發(fā)出同時(shí)針對(duì)LAG3和PD-1兩個(gè)靶點(diǎn)的雙特異性免疫檢查點(diǎn)阻斷劑FS118和MGD013，以達(dá)到用一種治療藥物同時(shí)阻斷兩種抑制途徑的目的[9]。這一類藥物具有很大的臨床應(yīng)用潛力，期待能夠產(chǎn)生較單靶點(diǎn)阻斷更好的效果。

4 小結(jié)與展望

LAG3被認(rèn)為是很有潛力的新一代免疫檢查點(diǎn)之一。基于充分的臨床前研究，關(guān)于LAG3的臨床試驗(yàn)已經(jīng)在多種類型的腫瘤中展開(kāi)。但仍有諸多問(wèn)題亟待解決：首先，LAG3的生物學(xué)特性復(fù)雜，其與配體結(jié)合后的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍不明確，這對(duì)于研究以LAG3為靶點(diǎn)的藥物十分必要；其次，最近發(fā)現(xiàn)的LAG3配體是FGL1，猜測(cè)LAG3可能還會(huì)存在其他配體，未來(lái)是否能夠發(fā)現(xiàn)對(duì)抗腫瘤作用更為有利的配體作為作用點(diǎn)？再次，機(jī)體的免疫系統(tǒng)存在高度的功能冗余，以確保在一個(gè)或多個(gè)共抑制受體途徑缺陷的情況下仍能維持免疫穩(wěn)態(tài)和正常的免疫耐受[6]，而不同的免疫檢查點(diǎn)作用機(jī)制不同，它們之間是否存在特殊的相互作用模式、如何相互作用的，以及如何尋求最優(yōu)組合治療方案？眾所周知，ICI的臨床應(yīng)答率有限，因此應(yīng)尋求合適的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物以篩選合適的人群，更有利于實(shí)現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)治療。已有研究分析LAG3的表達(dá)與治療反應(yīng)率的關(guān)系，相信不久的將來(lái)會(huì)有更多的研究針對(duì)此方向進(jìn)行分析。總體而言，對(duì)LAG3的研究尚處于早期階段，仍需繼續(xù)深入研究，以期能夠帶來(lái)更多的臨床獲益。