高糖狀態(tài)通過升高缺氧誘導(dǎo)因子-1α促進(jìn)胰腺癌的侵襲能力

秦濤 肖瑩 劉晗 黎韡 仵正 王錚 馬清涌 馬吉光

1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710061；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝膽外科，濟(jì)南 250012；3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，西安 710061

糖尿病與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[1-5]。實(shí)體腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中局部微環(huán)境最顯著的變化是缺氧，腫瘤細(xì)胞也通過改變代謝方式和增加抗氧化應(yīng)激能力等適應(yīng)缺氧環(huán)境，因此缺氧與腫瘤的血管形成、腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)及化療耐藥等惡性進(jìn)展密切相關(guān)[3]。研究表明，糖尿病是胰腺癌的危險(xiǎn)因素同時(shí)也是胰腺癌的促進(jìn)因素[6]，也有報(bào)道認(rèn)為糖尿病是胰腺癌的早期臨床表現(xiàn)之一，血糖升高是胰腺癌所引起的后果[7]。胰腺癌處于缺氧微環(huán)境，這一狀態(tài)與其高侵襲特征密切相關(guān)[8]。另一方面，胰腺癌合并糖尿病因高糖狀態(tài)使血管內(nèi)皮功能下降、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、毛細(xì)血管基底膜增厚等微循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)改變，不僅造成胰腺組織內(nèi)的灌流量下降，血供氧供減少，同時(shí)還引起氧氣彌散功能下降，進(jìn)一步加重組織缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是維持細(xì)胞和全身氧穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)分子，缺氧條件下腫瘤通過HIF-1α調(diào)節(jié)糖代謝、血管形成、細(xì)胞增殖和組織重建，從而促進(jìn)其細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成、代謝和化療耐藥等作用[9]。本研究通過胰腺癌臨床病理資料分析及建立糖尿病裸鼠胰腺原位移植瘤模型，探討糖尿病狀態(tài)下胰腺內(nèi)的高糖和缺氧微環(huán)境促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力的可能機(jī)制，對(duì)現(xiàn)有的糖尿病促進(jìn)胰腺癌理論進(jìn)行支持和補(bǔ)充。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2012年1月至2014年12月間西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院46例行胰腺癌手術(shù)切除患者臨床資料，其中男性25例，女性21例，年齡(54±12)歲。按照測(cè)得的空腹血糖水平分為血糖正常組(≥3.9 mmol/L～<6.1 mmol/L)28例和高血糖組(≥6.1 mmol/L)18例。記錄患者的腫瘤體積，有無膽管、血管侵犯，胰周脂肪組織浸潤(rùn)程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況。

二、胰腺癌組織HIF-1α表達(dá)檢測(cè)

采用常規(guī)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胰腺癌組織的HIF-1α表達(dá)。HIF-1α一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，工作濃度1∶100，二抗購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，工作濃度1∶1 000，最后DAB顯影，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水后中性樹脂封片，由病理科醫(yī)師顯微鏡下閱片。并使用Image J軟件中的IHC Profiler插件進(jìn)行定量評(píng)分，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為4分，陽(yáng)性(++)為3分，弱陽(yáng)性(+)為2分，陰性(-)為1分。HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)越高，則組織的缺氧狀態(tài)越嚴(yán)重。

三、糖尿病裸鼠胰腺原位移植瘤模型的構(gòu)建

從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司購(gòu)買20只4～6周齡的雌性裸鼠，體重20 g左右。普通飼養(yǎng)適應(yīng)1周后將裸鼠隨機(jī)分為高血糖組和血糖正常組，每組10只。制模前禁食16 h，采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)200 mg/kg (即0.2 ml/10 g)的方法制備糖尿病模型。1周后測(cè)裸鼠血糖，以連續(xù)兩次血糖≥20 mmol/L且尿糖陽(yáng)性為標(biāo)準(zhǔn)判斷糖尿病模型是否構(gòu)建成功。

人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3(中度分化)購(gòu)于中科院上海細(xì)胞生物研究所，常規(guī)復(fù)蘇傳代。取107個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BxPC3細(xì)胞接種于正常裸鼠皮下，待皮下瘤形成后處死荷瘤鼠，皮膚消毒，取出腫瘤，剪成1 mm3的腫瘤組織塊，浸入生理鹽水中備用。腹腔注射4%水合氯醛溶液(0.01 ml/g)對(duì)上述高血糖組和血糖正常組裸鼠進(jìn)行麻醉后，皮膚常規(guī)消毒，于左上腹部行1 cm的縱行切口，暴露胰腺，剪開胰腺被膜，將1 mm3的瘤塊植入胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)后縫合固定。6周后處死裸鼠，切取胰腺原位移植瘤，測(cè)腫瘤體積(V)[V(cm3)=1/2× 長(zhǎng)(cm)×寬(cm)×寬(cm)]，并觀察腫瘤侵犯和轉(zhuǎn)移情況。

四、裸鼠原位移植瘤內(nèi)缺氧狀態(tài)檢測(cè)

Hypoxyprobe-1是一種硝基咪唑類化合物，其化學(xué)成分是派諾咪唑，近年來被開發(fā)利用作為乏氧標(biāo)志物，用于檢測(cè)組織的缺氧狀態(tài)，其原理是利用還原硝基有選擇性結(jié)合乏氧細(xì)胞的能力，從而形成的一種從細(xì)胞水平測(cè)定腫瘤乏氧的技術(shù)[10]。裸鼠處死前1 h，腹腔注射10 mg/ml的Hypoxyprobe-1液(6 μl/g)，處死裸鼠后獲取移植瘤標(biāo)本，按Hypoxyprobe-1試劑盒(美國(guó)Hpi公司)說明書操作，即使用試劑盒中FITC耦聯(lián)的抗派諾咪唑的小鼠IgG單克隆抗體(FITC-MAb1抗體)孵育組織切片，通過搭配小鼠lgG-HRP二抗(美國(guó)Pierce公司)，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Hypoxyprobe-1積聚區(qū)域面積來判斷移植瘤組織缺氧程度。

五、胰腺癌BxPC3細(xì)胞的分組

體外培養(yǎng)胰腺癌BxPC3細(xì)胞，分為常規(guī)培養(yǎng)組(對(duì)照組)、高糖培養(yǎng)組(高糖組)、缺氧培養(yǎng)組(缺氧組)、高糖+缺氧組以及靶向HIF-1α的siRNA轉(zhuǎn)染組(siRNA-HIF-1α組)、高糖+siRNA-HIF-1α組，陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組(siRNA-NC組)和高糖+siRNA-NC組。

高糖組細(xì)胞用含25 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，缺氧組細(xì)胞用150 μmol/L的二氯化鈷(CoCl2)干預(yù)(美國(guó)Sigma公司)，因?yàn)镃oCl2中的二價(jià)鈷離子可通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合脯氨酸羥化酶(proline hydroxylase，PHD)中的二價(jià)鐵離子位點(diǎn)，抑制常氧狀態(tài)下 PHD 活性，可模擬缺氧狀態(tài)。

siRNA委托上海GenePharm公司設(shè)計(jì)與合成。siRNA-HIF-1α引物正向序列為5′-CCACCACUGAUGAAUUAAATT -3′，反向序列為5′-UUUAAUUCAUCAGUGGUGGTT-3′，siRNA-NC引物正向序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3′，反向序列為5′-ACGUGACAGGUUCGGAGAATT -3′。采用脂質(zhì)體LipofectamineTM3000(美國(guó)Invitrogen公司)將siRNA-HIF-1α、siRNA-NC分別轉(zhuǎn)染BxPC3細(xì)胞，按照說明書操作，轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。高糖+缺氧組及高糖+siRNA-HIF-1α組則將缺氧組或siRNA-HIF-1α組細(xì)胞換成用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。

六、胰腺癌BxPC3細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9, MMP-9)和HIF-1α表達(dá)檢測(cè)

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BxPC3細(xì)胞，采用RIPA裂解液(中輝赫彩公司)抽提細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白，調(diào)整濃度后常規(guī)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。MMP-9、β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，HIF-1α抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠、抗兔二抗均購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。最后ECL發(fā)光，X線曝光、顯影、定影。采用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)掃描圖像，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血糖正常組和高血糖組胰腺癌患者腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及瘤體體積比較

與血糖正常組比較，高血糖組胰腺癌患者的胰周脂肪組織浸潤(rùn)率(66.7%比57.1%)、血管侵犯率(50%比42.9%)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(27.8%比14.3%)均升高，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。高血糖組胰腺癌患者的腫瘤長(zhǎng)徑[(2.95±0.73)cm 比(2.09±0.70)cm]和膽管侵襲率(22.2%比0)均顯著高于血糖正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示高血糖能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲能力。

二、血糖正常組和高血糖組胰腺癌患者腫瘤組織HIF-1α表達(dá)比較

46例胰腺癌組織均有HIF-1α的表達(dá)，其中+ 18例(39.1%)，++17例(47.0%)，+++ 11例(23.9%)。18例高血糖組患者癌組織HIF-1α + 5例(27.8%)，++ 5例(27.8%)，+++ 8例(44.4%)；28例血糖正常組患者癌組織HIF-1α+ 13例(46.4%)，++ 12例(42.9%)，+++ 3例(10.7%)，高血糖組患者胰腺癌組織HIF-1α強(qiáng)表達(dá)比例高于血糖正常組，兩組間HIF-1α的表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.104，P=0.035)，提示高血糖能上調(diào)HIF-1α表達(dá)，加重胰腺癌缺氧的程度。

三、裸鼠胰腺原位移植瘤的缺氧狀態(tài)及腫瘤的惡性行為

高血糖組裸鼠胰腺原位移植瘤的Hypoxyprobe-1積聚區(qū)域面積顯著大于血糖正常組(圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(43.2±2.4)%比(13.5±1.3)%，t=24.33，P<0.01]；原位移植瘤的體積[(1.82±0.88)cm3比(0.75±0.21) cm3，t=19.17]及發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的比例(5/10比0/10)顯著高于血糖正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。高血糖組出現(xiàn)腹水的裸鼠只數(shù)多于血糖正常組(6/10比1/10)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高血糖能加重裸鼠胰腺移植瘤的缺氧狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

圖1 血糖正常組(1)和高血糖組(2)裸鼠胰腺原位移植瘤的缺氧探針Hypoxyprobe-1(1A、1B)和HIF-1α(1C、1D)表達(dá)(×100)

四、各組胰腺癌BxPC3細(xì)胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達(dá)的變化

高糖組、缺氧組BxPC3細(xì)胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(t值分別為37.97、48.99，36.74、48.99)，高糖+缺氧組BxPC3細(xì)胞的MMP-9和HIF-1α蛋白表達(dá)水平又顯著高于其他3組(t值分別為80.56、56.55、49.57，44.15、20.91、13.17)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖2，表1)。

圖2 對(duì)照組(1)、缺氧組(2)、高糖組(3)和高糖+缺氧組(4)BxPC3細(xì)胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

表1 各組胰腺癌BxPC3細(xì)胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達(dá)的比較

siRNA-HIF-1α組MMP-9和HIF-1α表達(dá)量顯著低于其他3組，高糖+siRNA-HIF-1α組MMP-9和HIF-1α的表達(dá)量顯著低于高糖+siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2，圖3)，提示抑制HIF-1α可下調(diào)MMP-9表達(dá)，而高糖可上調(diào)MMP-9和HIF-1α表達(dá)。

表2 各組胰腺癌BxPC3細(xì)胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達(dá)的比較

圖3 siRNA-NC組(1)、高糖+siRNA-NC組(2)、siRNA-HIF-1α組(3)和高糖+siRNA-HIF-1α組(4)BxPC3細(xì)胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達(dá) (蛋白質(zhì)印跡法)

糖尿病是胰腺癌的危險(xiǎn)因素，不僅可增加患者罹患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[6]，并且對(duì)已發(fā)生的胰腺癌具有明顯的促進(jìn)作用[11]，胰腺癌患者的餐后血糖升高水平與其病死率呈劑量依賴性關(guān)系。最近一項(xiàng)前瞻性研究表明，患有糖尿病的患者罹患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)是無糖尿病患者的兩倍，且血糖每增加1 mmol/L，胰腺癌的發(fā)病率升高15%[12]。對(duì)于可切除胰腺癌患者，如長(zhǎng)期患有糖尿病，其病死率增加[13]。本課題組前期體外研究結(jié)果顯示，高糖微環(huán)境通過GDNF/RET及EGF/EGFR信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖[14-15]。本研究結(jié)果顯示，伴有糖尿病的胰腺癌患者出現(xiàn)胰周脂肪組織浸潤(rùn)、血管侵犯以及胰周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的例數(shù)、腫瘤生長(zhǎng)速度、腫瘤膽管侵犯例數(shù)均大于血糖正常組，表明糖尿病可促進(jìn)胰腺腫瘤的生長(zhǎng)及增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

由于腫瘤生長(zhǎng)過快等多種因素的影響，實(shí)體瘤普遍存在缺氧狀況。缺氧微環(huán)境是胰腺癌顯著特征之一，與腫瘤的進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療敏感性等密切相關(guān)[16]。HIF-1α是細(xì)胞對(duì)氧濃度變化的主要調(diào)節(jié)因子。缺氧條件下，HIF-1α穩(wěn)定性增加，降解減少，在細(xì)胞中表達(dá)增加，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與靶基因的缺氧反應(yīng)原件結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[17]，從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，HIF-1α可以通過影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控腫瘤的侵襲遷移過程。已有研究證實(shí)，高血糖可以誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧和線粒體活性氧的生產(chǎn)[18]。本研究結(jié)果顯示，46例胰腺癌組織中均有HIF-1α的表達(dá)，且伴有高血糖的胰腺癌組織HIF-1α表達(dá)水平顯著高于血糖正常狀態(tài)下的胰腺癌。同樣在裸鼠胰腺癌原位移植瘤中，高糖組裸鼠的移植瘤組織內(nèi)HIF-1α表達(dá)上調(diào)，缺氧狀況更加明顯，也表明高血糖可以促進(jìn)裸鼠胰腺癌原位移植瘤的生長(zhǎng)并增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員之一，其在腫瘤中高表達(dá)與腫瘤的遷移侵襲有關(guān)。本研究體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖和缺氧都可以促使胰腺癌BxPC3細(xì)胞MMP-9和HIF-1α的表達(dá)水平上調(diào)，高糖和缺氧聯(lián)合干預(yù)時(shí)MMP-9和HIF-1α的表達(dá)水平更加顯著。采用RNA干擾技術(shù)沉默BxPC3細(xì)胞的HIF-1α基因表達(dá)后，高糖干預(yù)的BxPC3細(xì)胞的MMP-9表達(dá)水平降低。其原因可能是高糖狀態(tài)通過上調(diào)HIF-1α的表達(dá)來促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力，抑制HIF-1α基因的表達(dá)，可弱化高糖狀態(tài)對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突