基于3D-QSAR和分子對(duì)接設(shè)計(jì)新型缺氧誘導(dǎo)因子脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白1抑制劑

儲(chǔ) 涵，何華玉，何清秀，王 娟，林治華

缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）是由氧氣敏感的α亞基（HIF-1α、HIF-2α或 HIF-3α）和組成性表達(dá)的 β亞基（HIF-1β、HIF-2β或 HIF-3β）組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子［1］。在常氧環(huán)境中，HIF-α的羥基化和隨后的蛋白酶體降解能夠通過泛素連接酶系統(tǒng)對(duì)HIFs進(jìn)行負(fù)調(diào)控［2-3］。同時(shí)，HIFs也是有限氧環(huán)境中氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)器［4］。有研究表明：HIFs的穩(wěn)定性主要由HIF-α的翻譯后脯氨酰羥基化來調(diào)節(jié)，該反應(yīng)由缺氧誘導(dǎo)因子脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白（PHDs）催化［5-6］。PHDs是一組在多細(xì)胞動(dòng)物中充當(dāng)氧氣感受器的酶，同時(shí)PHDs作為一種非血紅素鐵（II）依賴的酶，有3種催化活性亞型（PHD-1，PHD-2和 PHD-3）［7-8］。其中，PHD-1主要存在于睪丸中，但也存在于腦、腎、心臟和肝臟中，PHD-2存在于大多數(shù)組織中，PHD-3只存在于心臟中［9-10］。這3種異構(gòu)體在其C端催化結(jié)構(gòu)域具有很高的序列同源性，但在其N端沒有序列同源性［11］。

目前，在諸多臨床環(huán)境中，包括炎癥性腸病，缺血再灌注損傷和神經(jīng)退變過程中，干擾PHDHIF軸成為了一種重要的治療方式［12-17］。常規(guī)的干擾方式（如Fe2+隔離劑等），由于缺乏特異性，在使用過程中存在很強(qiáng)的副作用［18-19］。1，2，4-三唑-［1，5-a］吡啶類化合物作為一類新型特異性PHD-1抑制劑，通過靶向 PHD-1干擾 PHD-HIF軸，避免了非特異抑制劑的副作用，也大大增強(qiáng)了療效。在本研究中，課題組收集了44個(gè)1，2，4-三唑-［1，5-a］吡啶類化合物，通過比較分子場分析（CoMFA）和比較分子相似性指數(shù)分析（CoMSIA），獲得了可靠的3D-QSAR模型。隨后，通過分子對(duì)接進(jìn)一步分析了PHD-1與該類化合物的結(jié)合模式。最后，基于上述結(jié)果，設(shè)計(jì)了8種新型1，2，4-三唑-［1，5-a］吡啶類 PHD-1抑制劑，并確定可用于進(jìn)一步研究的先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)選取

首先，根據(jù)文獻(xiàn)收集了 44個(gè) 1，2，4-三唑-［1，5-a］吡啶類化合物［20］，將它們隨機(jī)分為訓(xùn)練（36種化合物）和測試數(shù)據(jù)集（8種化合物，用符號(hào)“*”表示）。這些化合物的體外生物活性值以IC50表示，并轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的 pIC50（pIC50=-log IC50）。化合物的相關(guān)屬性見表1。

表1 化合物的實(shí)驗(yàn)和預(yù)測活性（pIC50）值

續(xù)表（表1）

1.2 結(jié)構(gòu)優(yōu)化和疊合

利用sybyl 2.0構(gòu)建這44個(gè)化合物，然后給每個(gè)化合物附加Gasteiger-Huckel電荷和Tripos力場。采用Powll能量梯度法對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，最大優(yōu)化上限10 000次，收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.005 kJ/mol，其余參數(shù)默認(rèn)［21］。所有處理過后的化合物構(gòu)象作為活性構(gòu)象用于下一步的研究，同時(shí)化合物21（如圖1，圖中加粗部分表示公共骨架）具有最高的抑制活性，可作為疊合模板。選擇適當(dāng)?shù)墓补羌芎?，所有化合物的疊合如圖2所示。

1.3 構(gòu)建3D-QSAR模型

CoMFA通過分析一組相似化合物周圍分子場的差異，得到這些分子與受體之間的非間相互作用的特性，從而預(yù)測其生物活性。CoMFA的靜電場和立體場分別采用Coalomb和Lennard-Jones勢函數(shù)，而CoMSIA還引入了高斯距離函數(shù)，通過疏水，氫鍵受體和供體場計(jì)算探針與分子的每個(gè)原子之間的相似性指數(shù)［22-23］。通過留一法（LOO）交叉驗(yàn)證程序計(jì)算了相關(guān)模型的最佳組件數(shù)（n）和最高交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（q2）。常規(guī)的多重相關(guān)系數(shù)（r2），估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEE）和 Fisher檢驗(yàn)（F）值是通過非交叉驗(yàn)證的分析獲得的［24-25］。利用3D-QSAR模型的等勢圖研究分子結(jié)構(gòu)對(duì)生物活性的影響，從而指導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)的修飾以提高其活性。

1.4 分子對(duì)接

PHD-1（PDB∶5v1b）晶體結(jié)構(gòu)來源于蛋白數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB），利用 Sybyl軟件對(duì)PHD-1晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫、加電荷等處理，同時(shí)，去除晶體結(jié)構(gòu)中的原配體小分子（8UY）。將原配體小分子范圍內(nèi)0.5 nm的氨基酸殘基作為對(duì)接口袋區(qū)域，并以其為參考分子，其余參數(shù)為默認(rèn)值［26］?；谏鲜鰠?shù)，將所有化合物與其對(duì)接，如圖3，使用PyMOL軟件進(jìn)行對(duì)接可視化。

2 結(jié)果與討論

2.1 3Q-QSAR模型

以36個(gè) 1，2，4-三唑-［1，5-a］吡啶類化合物為訓(xùn)練集，CoMFA和CoMSIA建模后的計(jì)算結(jié)果顯示在表2中。CoMFA模型和CoMSIA模型的穩(wěn)定性可以用交叉驗(yàn)證的q2來表示。一般情況下，當(dāng)q2大于0.3時(shí)，所構(gòu)建的模型僅在5%水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)q2大于0.5時(shí)，模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

空間場和靜電場構(gòu)建的CoMFA模型最佳，LOO的q2為0.712，表明該模型具有良好的穩(wěn)定性和可預(yù)測性。此外，CoMFA模型的n值為7，r2為0.969，F(xiàn)值為123（認(rèn)為可靠的F＞100），SEE為0.222，說明該模型具有良好的統(tǒng)計(jì)意義。在CoMSIA模型中，空間場、靜電場、疏水場，氫鍵供體場和受體場的組合表現(xiàn)良好（q2=0.754，r2=0.985），同時(shí)其余參數(shù)也可證明（F=159，SEE=0.165）。3D-QSAR模型的訓(xùn)練集與測試集的線性相關(guān)性分析如圖4所示。CoMFA與CoMSIA模型中訓(xùn)練集與測試集的大部分化合物都位于或接近趨勢線附近，證明了化合物實(shí)際活性值與預(yù)測活性值（以pIC50表示）的擬合度較好。

表2 3D-QSAR模型的計(jì)算結(jié)果

2.2 CoMFA和CoMSIA三維等勢圖分析

使用實(shí)際活性最高的的化合物21作為模板進(jìn)行CoMFA與CoMSIA的三維等勢圖分析。如圖5所示，CoMFA立體場、COMSIA靜電場、疏水場和氫鍵受體場貢獻(xiàn)較高，可用于指導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)修飾和改造。

圖5 （a）是 CoMFA的立體場輪廓圖。綠色（貢獻(xiàn)80%）和黃色（貢獻(xiàn)20%）區(qū)域的組合表明：在化合物的苯環(huán)連接的-CN處以體積較大的基團(tuán)取代能夠增強(qiáng)活性。化合物10（pIC50值為4.59）在該處以較大體積的基團(tuán)-OMe取代，相較于無取代基的化合物13（pIC50值為 4.21）活性更高。CoMSIA的靜電場等勢圖見圖5（b），藍(lán)色區(qū)域表示在此處增加負(fù)電性基團(tuán)有利于提高化合物的活性；紅色區(qū)域表示在此處以正電性基團(tuán)取代更好。這種結(jié)合表明：三唑環(huán)帶有負(fù)電荷的基團(tuán)有利于活性?；衔?9（pIC50值為7.89）的-NH2取代負(fù)電性更強(qiáng)，比-CH3修飾的化合物18（pIC50值為7.41）有更優(yōu)異的活性。CoMSIA的疏水場等勢圖見圖5（c），白色區(qū)域表示在此處增加親水性基團(tuán)有利于提高化合物的活性，黃色區(qū)域表示在此處以疏水性集團(tuán)取代更好。因此，在化合物的苯環(huán)連接的-CN處以親脂性的基團(tuán)取代能夠增強(qiáng)活性。CoMSIA的氫鍵受體場等勢圖顯示在圖5（d）中。紅色部分表示在此處減少氫鍵受體有利于活性的提升。因此，在苯環(huán)上的需要更多的非氫鍵供體。這些已通過系統(tǒng)中的某些化合物確認(rèn)。在化合物26和27中，化合物27（pIC50值為7.30）以-H取代，提供氫鍵供體而非氫鍵受體，其活性明顯高于-CF3取代的化合物26（pIC50值為5.73）。

2.3 分子對(duì)接模型分析

為了探索PHD-1與配體的結(jié)合方式，利用SYBYL軟件的Surflex-Dock模塊進(jìn)行分子對(duì)接，如圖6所示。在對(duì)接所有化合物前，將PHD-1共晶配體8UY重新對(duì)接到結(jié)合囊中來驗(yàn)證所使用的方法和參數(shù)是否可靠可行。如圖7所示，8UY分子重新對(duì)接的構(gòu)型與其共晶配體構(gòu)型基本一致，兩種構(gòu)型的RMSD為0.2?（＜2.0?）。化合物中的三唑環(huán)上的N原子直接與金屬Fe結(jié)合，這種特征的相互作用與以往的研究是一致的。這也說明所生成的對(duì)接協(xié)議是可靠的，可用于后續(xù)的研究。

本研究選擇化合物21作為分析結(jié)合模式的模板，并用二維圖（圖8）和三維圖（圖6）進(jìn)行展示。首先，化合物21三唑環(huán)上的氮原子與活性部位的Fe形成Fe-N鍵（2.0?）。與苯環(huán)相連的NH連接體與ASP238形成了一個(gè)距離為2.4?的強(qiáng)氫鍵。值得注意的是化合物另一端的氰基與Asn315也形成了一個(gè)強(qiáng)氫鍵（2.3?）。這種氫鍵的結(jié)合方式保證了其穩(wěn)定性。此外，化合物21與PHD-1之間存在豐富的疏水相互作用。Tyr287與該化合物的苯環(huán)之間都存在Pi-Pi相互作用（3.3 ?）。此外，Ala369與該苯環(huán)之間也存在著一個(gè)疏水作用（5.9?）。另外，Ile311與三唑環(huán)之間還存在著一個(gè)弱疏水作用（3.9?）。豐富的疏水相互作用和氫鍵在配體與受體的結(jié)合中起著關(guān)鍵作用，它們可以使化合物與受體的結(jié)合更加穩(wěn)定。

2.4 新型化合物的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)

通過分析3D-QSAR的等勢圖和分子對(duì)接模型，以化合物21為先導(dǎo)化合物，確定該類化合物的修飾區(qū)域。通過在苯環(huán)附近引入氫鍵受體和體積較大的疏水性基團(tuán)，在三唑環(huán)附近引入正電荷基團(tuán)，本文共設(shè)計(jì)了 8個(gè)新的1，2，4-三唑-［1，5-a］吡啶類化合物。

對(duì)于這8個(gè)新設(shè)計(jì)的化合物，首先通過建立的3D-QSAR模型預(yù)測了其活性，其次將其與PHD-1對(duì)接并打分?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)，預(yù)測活性以及對(duì)接得分如表3所示。結(jié)果表明：所有新化合物抑制活性較高，且對(duì)接得分也較高，尤其是化合物21-g，其預(yù)測活性相較于化合物21有明顯的提升，同時(shí)它與PHD-1的對(duì)接得分也同樣有所提升。這表明，相較于其余修飾化合物的方式，在苯環(huán)附近引入氫鍵受體能夠很好地提高該類化合物與PHD-1結(jié)合的穩(wěn)定性，從而大大提升1，2，4-三唑-［1，5-a］吡啶類化合物作為特異性PHD-1抑制劑的活性。

同時(shí)，由于化合物21-g具有出色的預(yù)測活性和對(duì)接評(píng)分，因此它可作為新型 1，2，4-三唑-［1，5-a］吡啶類PHD-1抑制劑的先導(dǎo)化合物，用作進(jìn)一步的研究。

表3 新設(shè)計(jì)化合物的結(jié)構(gòu)和預(yù)測活性

3 結(jié)論

本文中結(jié)合3D-QSAR和分子對(duì)接技術(shù)研究了1，2，4-三唑-［1，5-a］吡啶類 PHD-1抑制劑。所建立的3D-QSAR模型揭示了PHD-1抑制劑結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的關(guān)鍵因素，這些關(guān)鍵因素可用于指導(dǎo)該類化合物的改造和設(shè)計(jì)。此外，分子對(duì)接技術(shù)被用于探索蛋白晶體活性位點(diǎn)中的關(guān)鍵氨基酸與配體分子的對(duì)接模式。通過分析空間場、疏水場、靜電場和氫鍵受體場的等勢圖，以及1，2，4-三唑-［1，5-a］吡啶類化合物與PHD-1的對(duì)接模型，設(shè)計(jì)了8種新的該類化合物。新型化合物評(píng)價(jià)結(jié)果表明：它們都具有良好的預(yù)測活性和較好的對(duì)接得分，尤其是化合物21-g，可作為先導(dǎo)化合物做進(jìn)一步研究。這些結(jié)果為特異性PHD-1抑制劑的合理設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。