體外受精-胚胎移植（IVF-ET）胚胎培養(yǎng)液中HLA-G檢測(cè)在預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能和臨床結(jié)局中的應(yīng)用價(jià)值研究

羅 平，沈開元，盧 娜，羅江霞，黃 芬，劉剛毅（柳州市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，廣西柳州 545006）

關(guān)健詞：體外受精-胚胎移植；胚胎培養(yǎng)上清液；可溶性人類白細(xì)胞抗原G；發(fā)育潛能；臨床結(jié)局

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)的誕生為廣大不孕不育患者解決了生育難題，雖然該技術(shù)的臨床妊娠率已達(dá)到40%～60%，但因?yàn)樽非笕焉锫识鴮?dǎo)致的多胎妊娠已成為最常見的并發(fā)癥之一，其帶來(lái)的孕產(chǎn)期風(fēng)險(xiǎn)及后代安全隱患越來(lái)越明顯，因此選擇具有發(fā)育潛能的單胚胎移植以避免多胎妊娠已經(jīng)成為趨勢(shì)。目前評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量的主要方法是形態(tài)學(xué)評(píng)估法，但該方法具有一定的局限性[1]，不能很好地預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育潛能。人類白細(xì)胞抗原HAL-G（human leukocyte antigen G，HLA-G）基因在1987年被成功克隆，它是組織主要相容性抗原（major histocompatability complex, MHC）Ib 類 家族成員，與其他HLA I 基因具有同源的分子結(jié)構(gòu)[2]，HLA 家族蛋白廣泛應(yīng)用于癌癥以及一些遺傳疾病的診斷[3]，是一類敏感性較高的疾病標(biāo)記物。HLA-G已被證實(shí)在未受精的卵母細(xì)胞及早期胚胎的二細(xì)胞至囊胚階段均有表達(dá)，其表達(dá)水平在每個(gè)發(fā)育階段的胚胎中都有著不同的變化[4]，在早期胚胎的培養(yǎng)液中也檢測(cè)到可溶性HLA-G 的存在并且證實(shí)其蛋白表達(dá)濃度可能與妊娠結(jié)局密切相關(guān)[5-6]。本研究通過(guò)檢測(cè)胚胎培養(yǎng)上清液中的HLA-G 含量，探討HLA-G 在評(píng)估早期胚胎質(zhì)量、預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能中的應(yīng)用價(jià)植，為臨床實(shí)施選擇性單胚胎移植提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年12月～2019年8月在我院生殖醫(yī)學(xué)科接受輔助生殖技術(shù)IVF-ET 治療的不孕不育夫婦共156 對(duì)，女方平均年齡34.25 歲，平均不孕年限3.56±1.89 歲，入組標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡≤37 歲，基礎(chǔ)激素水平正常，排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮內(nèi)膜異位癥或子宮畸形、腺肌癥；②輸卵管積水或?qū)m腔積液；③盆腔黏連；④有家族遺傳病史；⑤夫婦染色體核型分析異常。

1.2 試劑和儀器 胚胎培養(yǎng)液購(gòu)自瑞典Vitrolife 公司，胚胎冷凍液、解凍液購(gòu)自日本KITAZATO 公司，HLA-G 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自捷克Exbio 公司，胚胎培養(yǎng)箱（型號(hào)：C200）購(gòu)自德國(guó)Labotect 公司，酶標(biāo)儀（型號(hào)：MK-3）購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher 公司。

1.3 方法

1.3.1 促排卵及取卵：嚴(yán)格按本中心超促排卵方案促排卵，當(dāng)有2 個(gè)或以上卵泡直徑達(dá)到18mm 時(shí)注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）板機(jī)啟動(dòng)，36h 后通過(guò)陰道B 超引導(dǎo)下穿刺取卵，所獲得卵冠丘復(fù)合物清洗干凈后置于受精培養(yǎng)液內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2～4h 后授精。

1.3.2 胚胎培養(yǎng)：授精后18～20h 將已拆除顆粒細(xì)胞的受精卵轉(zhuǎn)入卵裂培養(yǎng)基微滴（G1，Vitrolife，瑞典）置于6ml/dl CO2，5ml/dl O2，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，標(biāo)記正常受精卵。受精后第3 天（D3）對(duì)胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)（細(xì)胞發(fā)育速度、卵裂球數(shù)目、均一性及碎片率）評(píng)分，胚胎評(píng)分Ⅰ、Ⅱ級(jí)為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅲ級(jí)以上為可用胚胎，Ⅳ級(jí)為不可用胚胎丟棄。本中心優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)：卵裂球6～10 個(gè)，大小均一，碎片率≤20%，胞質(zhì)均勻。根據(jù)患者情況選取評(píng)分最高的2 個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎移植或冷凍，剩余可用胚胎（Ⅲ級(jí)以上正常受精胚胎）繼續(xù)培養(yǎng)至第5 天（D5）觀察囊胚形成情況，采用單個(gè)培養(yǎng)法（每個(gè)液滴放一個(gè)胚胎）培養(yǎng)。用Gardner 評(píng)分系統(tǒng)[7]進(jìn)行囊胚評(píng)分，D5 評(píng)分≥3BB 或D6 ≥4BB 視為優(yōu)質(zhì)囊胚，優(yōu)質(zhì)囊胚、可用囊胚移植或冷凍保存，不可用囊胚知情溝通后丟棄。

1.3.3 臨床結(jié)局：胚胎移植14 天后測(cè)尿HCG 或血β-HCG，移植后4 周B 超檢測(cè)孕囊及胎心搏動(dòng)以確定是否臨床妊娠。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)：分別收集第3 天優(yōu)質(zhì)胚胎及第5 天囊胚移植或冷凍后其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)上清液30～35ul,保存于0.5ml 的EP 管中，標(biāo)記后-20℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)培養(yǎng)液中HLA-G 濃度，所有檢測(cè)步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 驗(yàn)驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，各組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同妊娠結(jié)局患者基本情況和HLA-G 檢測(cè)結(jié)果比較 本研究共納入156 對(duì)助孕患者總計(jì)194 個(gè)新鮮胚胎（D3 胚胎和D5 囊胚）移植周期，根據(jù)妊娠結(jié)局分為臨床妊娠組和未妊娠組，兩組患者情況見表1。數(shù)據(jù)顯示兩組患者的平均年齡、不孕年限、抗苗勒氏管激素（AMH）、促性腺激素（Gn）天數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、平均獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），妊娠組胚胎培養(yǎng)液中的HLA-G 表達(dá)水平顯著高于未妊娠組和生化妊娠組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。

表1 胚胎移植臨床結(jié)局各組間基本情況及HLA-G 濃度的比較

2.2 D3 胚胎繼續(xù)培養(yǎng)囊胚形成情況及HLA-G 在不同級(jí)別囊胚中的表達(dá) 根據(jù)D3 繼續(xù)培養(yǎng)胚胎級(jí)別分為 8 細(xì)胞優(yōu)質(zhì)胚胎組、其它優(yōu)質(zhì)胚胎組、8 細(xì)胞Ⅲ級(jí)胚胎組及其他可用胚胎組，比較各組囊胚形成情況，并分別檢測(cè)形成囊胚培養(yǎng)液中HLG-A 含量。結(jié)果顯示8 細(xì)胞優(yōu)質(zhì)胚胎組優(yōu)質(zhì)囊胚率、可用囊胚率及囊胚形成率顯著高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），形成優(yōu)質(zhì)囊胚、可用囊胚及不可用囊胚培養(yǎng)液的HLA-G 均值分別為12.36±5.27，8.15±3.69 和5.62±3.10 U/ml，，三組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.856， P ＜0.05）。

表2 D3 胚胎繼續(xù)培養(yǎng)形成囊胚情況的比較[%(n)]

2.3 HLA-G 濃度和胚胎移植臨床結(jié)局的比較 見表3。根據(jù)移植胚胎培養(yǎng)液HLA-G 濃度，按D3 卵裂期胚胎≥2.5U/ml 或D5 囊胚≥6.8U/ml 分為高濃度組和低濃度組，比較兩組胚胎移植后臨床結(jié)局。結(jié)果顯示HLA-G 高濃度組臨床妊娠率、胚胎種植率顯著高于低濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，兩組之間的生化妊娠率和流產(chǎn)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

表3 HLA-G 濃度與胚胎移植臨床結(jié)局的相關(guān)性比較[%(n)]

3 討論

自JURISICOVA A[4]等首次在培養(yǎng)液中檢出HLA-G 后，隨著研究的深入HLA-G 被認(rèn)為對(duì)人類胚胎的發(fā)育和成功植入具有重要意義，多篇報(bào)道也指出sHLA-G 可以作為評(píng)價(jià)體外受精胚胎質(zhì)量的指標(biāo)并且能夠獲得更好的移植效果[8-10]。檢測(cè)培養(yǎng)上清液HLA-G 用來(lái)篩選更具發(fā)育潛能的優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，有利于降低多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)并能獲得很好的臨床結(jié)局。HLA-G 對(duì)人類早期胚胎植入影響的機(jī)理為HLA-G 能夠阻止由母源毒性淋巴細(xì)胞引起的同種識(shí)別以及保護(hù)目標(biāo)細(xì)胞免受自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell, NK-cell）介導(dǎo)的溶解[11]，抑制子宮自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活化的CD8 細(xì)胞中表達(dá)的因子，從而保護(hù)胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞免受NK 細(xì)胞殺傷[12]。通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放在胚胎與母體免疫耐受機(jī)制之間建立相應(yīng)的“化學(xué)對(duì)話”以確保胎兒在母體內(nèi)能安全發(fā)育[13-14]。

本研究結(jié)果顯示，胚胎移植臨床妊娠組培養(yǎng)液中HLA-G 濃度均值顯著高于未妊娠組和生化妊娠組，形成囊胚組培養(yǎng)液中HLA-G 的濃度高于非囊胚組，優(yōu)質(zhì)囊胚組高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。證實(shí)HLA-G 蛋白特異表達(dá)于囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)并促使其往胎盤發(fā)育，通過(guò)調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入能力并且促使子宮螺旋動(dòng)脈血管的重塑為胚胎的成功著床和妊娠維持做好準(zhǔn)備，其表達(dá)水平和臨床結(jié)局密切相關(guān)，可作為評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育潛能的客觀指標(biāo)，為挑選單個(gè)胚胎移植避免多胎妊娠提供依據(jù)。對(duì)于全胚冷凍或冷凍周期，選擇HLA-G 表達(dá)水平高的胚胎（囊胚）移植，中心的臨床妊娠率可由55%左右提高到69%，生化妊娠率和流產(chǎn)率降低至5%和3%。對(duì)于表達(dá)較高濃度HLA-G 的胚胎仍有31%左右未能成功妊娠，除與患者本身的機(jī)體狀態(tài)、子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)外，有研究[15]顯示培養(yǎng)至第3日的胚胎種植前遺傳學(xué)診斷（PGD）染色體顯示異常時(shí)其培養(yǎng)液中仍可檢測(cè)到HLA-G 表達(dá)，提示染色體的異常可能影響了這部分胚胎的植入。同時(shí)我們還觀察到對(duì)于第三天8 細(xì)胞Ⅲ級(jí)胚胎其囊胚形成率、HLA-G 水平與第三天非8 細(xì)胞優(yōu)質(zhì)胚胎相比差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示其亦具有較好的發(fā)育潛能，8 細(xì)胞優(yōu)胚的囊胚形成率、HLA-G 含量與其他各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示我們?cè)诮窈蟮呐咛バ螒B(tài)學(xué)評(píng)分中應(yīng)以胚胎的發(fā)育速度和卵裂球的均一性為主要評(píng)分依據(jù)。即往的文獻(xiàn)報(bào)道大多為檢測(cè)第三天胚胎上清液HLA-G 表達(dá)水平，本研究中168 枚可用囊胚培養(yǎng)上清液HLA-G 均值顯著高于第三天優(yōu)質(zhì)胚胎。證實(shí)HLA-G 隨著胚胎的不斷分化而升高，可作為胚胎發(fā)育潛能的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。

本研究的局限在于僅納入≤37 歲、卵巢功能正?；颊咔覚z測(cè)例數(shù)有限，對(duì)于卵巢低反應(yīng)或高齡尤其是≥40 歲患者，由于卵子的數(shù)量和質(zhì)量下降，胚胎的發(fā)育潛能有限形成囊胚的幾率也隨之降低[16]，進(jìn)行囊胚培養(yǎng)失敗的幾率升高而導(dǎo)致移植周期取消[17]，給患者造成較大的經(jīng)濟(jì)和心理上的壓力，檢測(cè)D3 胚胎培養(yǎng)液HLA-G 水平也許更有利于選擇有發(fā)育潛能的胚胎移植。本研究結(jié)果真正應(yīng)用于臨床還需要更多的數(shù)據(jù)和擴(kuò)大檢測(cè)范圍來(lái)證實(shí)。同時(shí)由于ELISA 方法的局限性，培養(yǎng)液中雜質(zhì)的干擾及檢測(cè)的特異度、敏感度都會(huì)影響到檢測(cè)值的真實(shí)性，而且檢測(cè)尚未具備上機(jī)自動(dòng)化操作，因此對(duì)于移植前HLA-G 水平的檢測(cè)僅限于冷凍胚胎移植周期而不適用于新鮮胚胎移植周期。

綜上所述胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分結(jié)合HLA-G 值可較好預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能，改善臨床結(jié)局，為實(shí)施單胚胎移植策略提供客觀依據(jù)。相較于其他侵入性檢測(cè)方法而言，不僅能避免對(duì)胚胎的損害，同時(shí)也為評(píng)價(jià)早期胚胎的發(fā)育潛能提供客觀依據(jù)。雖然在檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)以及靈敏度上仍然存在不少的爭(zhēng)議，但不可否認(rèn)利用HLA-G 作為生物學(xué)標(biāo)記預(yù)測(cè)早期胚胎發(fā)育潛能仍具有巨大的應(yīng)用前景。