腦外傷后血清外泌體miR-451的表達變化及意義*

潘長福,婁遠蕾,段景麗,余兆祥,何燕,翁中海

景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院 1神經(jīng)外科， 3急診科(江西景德鎮(zhèn) 333000)；2南昌大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所(江西南昌 330006)

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)具有很高的發(fā)病率，是全球主要的致死、致殘性疾病之一[1]。目前其診斷、損傷嚴重程度及預后評估主要依賴于神經(jīng)系統(tǒng)檢查和神經(jīng)影像學檢查，然而兩者皆有一定局限性。外泌體(exosomes)是一種直徑40～150 nm的脂質(zhì)雙分子層囊泡，其內(nèi)包含有各種生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸(包括miRNA)等，并且可以在外周血中穩(wěn)定存在，目前已知幾乎所有類型的細胞均可以分泌外泌體[2-3]。microRNAs(miRNA)是一類內(nèi)源性單鏈小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，參與調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等多種病理生理過程[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷具有重要意義，是一種可靠的生物學指標[5-7]。同樣，已有研究證實，腦外傷后腦組織、血清內(nèi)miR-451表達量發(fā)生急劇變化[8-10]，具有潛在的生物指標價值[10]，然而腦外傷后血清外泌體miR-451表達變化如何，目前尚鮮見報道。本研究擬檢測腦外傷患者傷后血清外泌體miR-451的動態(tài)表達變化，探討其對腦外傷診斷、損傷嚴重程度及預后評估的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 依據(jù)格拉斯哥評分(Glasgow Coma Scale，GCS)，可將TBI分為輕型(GCS 13～15分)、中型(GCS 9～12分)和重型(GCS 3～8分)[11]。本研究選擇2018年7月1日至2019年6月30日在景德鎮(zhèn)市第一人民神經(jīng)外科收治的120例腦外傷患者(輕、中、重型各40例)。病例入選標準：(1)明確頭部外傷史，傷后有昏迷、記憶缺失或定向力障礙等癥狀，或經(jīng)顱腦CT證實有顱腦外傷陽性結(jié)果者；(2)年齡18～75歲；(3)受傷后4 h內(nèi)入院。排除標準：(1)嚴重心、腦、肝、腎等慢性病史；(2)受傷前有飲酒、使用毒麻及鎮(zhèn)靜藥物；(3)精神、智力異常或存在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾??；(4)妊娠；(5)傷后7 d內(nèi)死亡或出院。所有患者根據(jù)病情變化采取脫水、止血、手術(shù)和營養(yǎng)支持等對癥治療。另選取40名健康成年體檢者作為對照組。本研究已經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準，并取得患者及(或)家屬知情同意。

腦外傷組男72例，女48例，年齡(45.4±15.4)歲；對照組男22例，女18例，年齡(43±12.3)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 血清標本收集 入院后所有患者首次采血由急診科護士在傷后4 h內(nèi)完成，傷后1 d、3 d 和7 d采血由神經(jīng)外科住院部護士完成，每次采集靜脈血5 mL，健康體檢者于空腹時留取靜脈血。靜脈血先在室溫下3 000×g離心30 min，再以16 000×g離心15 min后吸取上層去除細胞的血清，以去RNA酶EP管分裝并保存在-80℃冰箱中備用。

1.3 血清外泌體提取及鑒定 采用血清外泌體試劑盒(Thermo Scientific公司)提取血清中的外泌體，提取步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。提取完成后采用電鏡鑒定外泌體形態(tài)，采用Western blot鑒定外泌體表面蛋白CD63及CD9。

1.4 miR-451檢測 采用Trizol試劑盒(Takara公司)提取外泌體總RNA；以PrimeScriptTMRT reagent kit(Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，反應條件：42℃ 15 min，85℃ 5 s。采用SYBR熒光(Takara公司)real-time PCR技術(shù)，按miScript Primer Assays、miScript SYBR Green PCR Kit反應體系，使用ABI 7500 real-time PCR system進行擴增反應。反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。采用U6作為內(nèi)參，健康體檢者血清為對照，用2-ΔΔCt表示各組血清外泌體miR-451的相對表達量，反應重復操作3次。

1.5 GOS評分 所有腦外傷患者于傷后6個月通過電話回訪或門診隨訪方式進行格拉斯哥預后(Glasgow Outcome Scale，GOS)評分，并分為預后良好組(GOS 4～5分)和預后不良組(GOS 1～3分)。GOS評分分級：1分為死亡；2分為植物生存，長期昏迷，呈去皮質(zhì)或去腦強直；3分為重殘，需他人照顧；4分為中度殘疾，生活能自理；5分為恢復良好，成人仍工作、學習[12]。

2 結(jié)果

2.1 腦外傷組的臨床資料比較 首次采血(4 h以內(nèi))GCS評分3～8分40例(33.3%)，9～12分40例(33.3%)，13～15分40例(33.3%)。預后不良(GOS 1～3分)29例(24.2%)，預后良好(GOS 4～5分)91例(75.8%)。受傷機制汽車/摩托車/電動車76例(63.3%)，摔傷/高處墜落21例(17.5%)，硬物打擊11例(9.2%)，其他12例(10.0%)。影像學檢查結(jié)果：硬膜下血腫64例，蛛網(wǎng)膜下腔出血68例，彌漫性軸索損傷25例，硬膜外血腫41例，腦挫裂傷76例，顱骨骨折69例。

2.2 血清外泌體鑒定 電鏡結(jié)果表明血清提取物具有明顯的外泌體膜狀結(jié)構(gòu)，直徑約100 nm，見圖1-A；Western blot顯示血清提取物表達外泌體標記蛋白CD63和CD9，見圖1-B。以上結(jié)果證實血清提取的沉淀物為外泌體。

2.3 血清外泌體miR-451在腦外傷患者中的診斷價值 real-time PCR結(jié)果顯示腦外傷(GCS 3～15分)和輕型顱腦損傷(GCS 13～15分)患者傷后4 h內(nèi)血清外泌體miR-451的表達水平分別為對照組的(3.46±0.32)倍和(2.12±0.21)倍，均明顯高于對照組(1.0±0.00)(P<0.01)。采用ROC曲線分析血清外泌體miR-451對腦外傷及輕型顱腦損傷的診斷價值，結(jié)果顯示兩者曲線下面積(AUC)分別為0.917(95%CI0.867～0.968，敏感度0.856，特異度0.900)和0.911(95%CI0.835～0.988，敏感度0.700，特異度1.000)，均具有較高的診斷效能，見圖2。

注：A：電鏡顯示血清提取物具有清晰的外泌體膜狀結(jié)構(gòu)，直徑約為100 nm；B：Western blot顯示隨機3個實驗樣本血清中提取物均表達外泌體特異蛋白CD63和CD9

注：A:腦外傷(GCS 3～15分)；B:輕型顱腦損傷(GCS 13～15分)

2.4 血清外泌體miR-451的表達量與腦外傷損傷嚴重程度的相關(guān)性 real-time PCR檢測輕、中、重型腦外傷患者傷后4 h內(nèi)及1 d、3 d、7 d血清外泌體miR-451的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)輕型顱腦損傷患者傷后4 h起血清外泌體miR-451表達明顯增高，1 d時達高峰，隨后逐漸下降，7 d時已恢復至正常水平；(2)中、重型腦外傷患者傷后4 h起血清外泌體miR-451表達明顯增高，3 d時達到峰值水平，隨后逐漸降低，7 d時仍維持在較高水平；(3)比較輕、中、重型顱腦損傷患者傷后同一時間點血清外泌體miR-451的表述水平，結(jié)果具有顯著差異性(P<0.05)，呈逐級升高趨勢；(4)Spearman相關(guān)性分析表明，傷后各時間點血清外泌體miR-451的表達水平與腦損傷嚴重程度呈正相關(guān)(r>0.70，P<0.001)。見表1、2。

表1 腦外傷后不同時間點血清外泌體miR-451表達量

表2 腦外傷后不同時間點血清外泌體miR-451的表達與腦損傷嚴重程度相關(guān)性分析

2.5 血清外泌體miR-451的表達量與腦外傷預后的相關(guān)性 依據(jù)腦外傷患者GOS評分，將其分為預后良好組(GOS 4～5分)和預后不良組(GOS 1～3分)，比較兩組患者傷后4 h內(nèi)及1 d、3 d和7 d血清外泌體miR-451的表達量。real-time PCR結(jié)果顯示，傷后同一時間點比較，預后不良組血清外泌體miR-451表達水平均較預后良好組明顯增高(P<0.01)；Spearman相關(guān)性分析表明，傷后各時間點血清外泌體miR-451的表達量與預后呈明顯負相關(guān)(r<-0.56，P<0.001)。見表3、4。

表3 腦外傷后不同時間點血清外泌體miR-451表達量

表4 腦外傷后不同時間點血清外泌體miR-451的表達與傷后6個月預后相關(guān)性

3 討論

miRNA為小分子單鏈RNA，通過結(jié)合非編碼區(qū)mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達和蛋白合成[13]。目前已有報道，miR-16、miR-92a、miR-451、miR-20a、miR-93、miR-191和miR-499等多種miRNA在腦外傷患者外周血和(或)腦脊液內(nèi)表達明顯增加，有望成為腦外傷潛在的特異性和敏感性指標[7，10，13-14]。然而，由于外周血內(nèi)miRNA很容易降解，限制了miRNA的生物指標價值[15]。外泌體是一類具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的囊性小泡，攜帶著從細胞釋放的蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等物質(zhì)[3]。目前已知中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)幾乎所有類型的細胞都可以分泌外泌體[16]。腦外傷后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞分泌外泌體，后者穿透血腦屏障并釋放入外周血中[15]。外泌體內(nèi)miRNA含量豐富，其雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)可避免miRNA降解[15]，因此檢測外周血內(nèi)外泌體miRNA可能對腦外傷的診斷與預后評估具有重要價值。

目前關(guān)于外周血外泌體miRNA對腦外傷的生物學價值研究尚未見報道。因本研究小組前期miRNA芯片檢測小鼠腦外傷4 h后腦海馬內(nèi)miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-451升高達165.8倍，在所有檢測的miRNA變化最為明顯[8]，本研究檢測腦外傷患者傷后血清外泌體miR-451的動態(tài)表達變化，探討其對腦外傷的診斷、損傷嚴重程度及預后評估中的意義。目前關(guān)于外周血miR-451表達量對腦外傷的生物標志價值研究極少，僅在2016年Bhomia等[10]有所報道。其研究發(fā)現(xiàn)，腦外傷患者傷后早期血清中miR-451表達明顯升高，其曲線下面積為0.82，對腦外傷的診斷具有中等診斷效能[10]，但該研究樣本量較小，且沒有對血清內(nèi)miR-451表達量與腦外傷嚴重程度及預后進行相關(guān)性分析。在本研究中，腦外傷患者早期(4 h內(nèi))血清外泌體miR-451表達水平較健康人群已明顯升高，其曲線下面積0.917，對腦外傷的診斷，具有較高的診斷效能。與Bhomia等[10]檢測血清miR-451比較，本研究結(jié)果提示檢測血清外泌體miR-451對腦外傷診斷具有更高的診斷效能，可能與外泌體內(nèi)miRNA性質(zhì)穩(wěn)定，不容易降解有關(guān)。輕型顱腦損傷患者神經(jīng)系統(tǒng)癥狀輕，頭顱CT、血清蛋白類分子檢查敏感性低，一直是腦外傷診斷中的難點[17]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)輕型顱腦損傷患者外傷后早期血清外泌體miR-451表達量明顯增加，其曲線下面積為0.911，具有較高的診斷效能，可能為輕型顱腦損傷患者的早期診治帶來一定幫助。

本研究還檢測了輕、中、重型顱腦損傷患者傷后血清外泌體miR-451的動態(tài)表達變化，發(fā)現(xiàn)輕型顱腦損傷患者血清外泌體miR-451在1 d時達高峰，隨后逐漸下降，7 d時恢復正常水平，與輕型顱腦損傷患者的病程較一致。中、重型顱腦損傷患者血清外泌體miR-451則在3 d時達高峰，7 d時仍維持在較高水平，可能有中、重型顱腦損傷病程長，水腫時限延長或二次損傷有關(guān)。輕、中、重型顱腦損傷患者傷后同一時間點比較，血清外泌體miR-451表達量逐級升高，并與腦損傷嚴重程度呈正相關(guān)，提示腦外傷后血清外泌體miR-451的表達量越高，腦損傷程度越重。對于腦外傷患者及家屬而言，預后情況是其最為關(guān)心的問題之一，目前臨床工作中，腦外傷預后評估主要依賴于神經(jīng)系統(tǒng)檢查和影像學檢查。本研究發(fā)現(xiàn)，腦外傷預后良好組(GOS 4～5分)血清外泌體miR-451表達量與預后不良組(GOS 1～3分)比較明顯降低，與GOS評分負相關(guān)，提示血清外泌體miR-451越高，其預后越差。因此血清外泌體miR-451的檢測，可能為腦外傷的預后評估提供了一種新的手段。

腦外傷發(fā)病機制非常復查，涉及炎癥、細胞凋亡、可塑性改變及神經(jīng)再生等[7]。miR-451是近年來研究較多的miRNA之一，參與造血系統(tǒng)分化、胚胎發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等多種病理和生理過程[18]。同樣，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理生理過程中，miR-451也發(fā)揮重要作用。Liu[19]和Li等[20]發(fā)現(xiàn)在腦缺血灌注損傷過程中，miR-451可以靶向抑制CELF2，保護神經(jīng)元，通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制炎癥反應；Nan等[21]發(fā)現(xiàn)miR-451可以靶向抑制mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路，進而抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲。Alural等[22]發(fā)現(xiàn)，miR-451參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程；Sun等[23]則發(fā)現(xiàn)miR-451可以通過靶向抑制TLR4，從而抑制小膠質(zhì)細胞活化介導的神經(jīng)炎癥反應。本研究小組和Meissner等發(fā)現(xiàn)腦外傷早期海馬及皮質(zhì)內(nèi)miR-451表達急劇升高[8-9]。在本研究中，腦外傷后血清外泌體miR-451表達量明顯增加，其表達量與腦損傷嚴重程度呈正相關(guān)，與GOS預后評分呈負相關(guān)。因此可以推測miR-451可能在腦外傷早期的病理生理過程和隨后的腦功能恢復過程中發(fā)揮重要作用，其具體作用機制值得進一步去研究。

綜上所述，本研究顯示腦外傷后血清外泌體miR-451表達水平明顯增高，其表達水平與腦損傷嚴重程度及預后相關(guān)，可作為腦外傷診斷、損傷嚴重程度及預后評估的潛在生物指標。相對于神經(jīng)影像學檢查而言，該檢測方法簡便、快捷，價格低廉，而且沒有輻射，具有潛在的臨床應用價值。但是，本研究樣本量較少，需要進一步擴大樣本和多中心進一步明確其參考區(qū)間及應用價值。