熒光染色技術(shù)在艾滋病患者活檢標(biāo)本病原學(xué)診斷中的應(yīng)用*

肖艷華,肖冠英,粟海霞,李凌華,陳諧捷

廣州市第八人民醫(yī)院 1病理科,2感染病中心(廣東廣州 510440)

機會性感染是指條件性病原體在人體免疫功能降低的情況下所發(fā)生的炎癥性疾病。艾滋病患者由于免疫功能低下，且呈進行性加重，其并發(fā)機會性感染的病原體種類多樣，臨床表現(xiàn)更加嚴(yán)重或復(fù)雜。同時，病原體血清學(xué)陽性率較低，給臨床診斷帶來了較大困難[1]。幾乎80%的艾滋病患者由于免疫功能缺陷而繼發(fā)機會性感染并導(dǎo)致死亡[2]。在之前的研究中，我們在3 258例艾滋病活檢標(biāo)本中查出特異性病原體感染檢出率39.7%，其感染的病原譜中分枝桿菌感染占50%，真菌感染占24.7%，分枝桿菌和真菌是艾滋病機會性感染病原體的主要類型[3]?，F(xiàn)有的真菌特殊染色(六胺銀、PAS染色)及抗酸分枝桿菌染色(萋尼抗酸染色)陽性率不高，操作過程復(fù)雜，費時費力，而快速真菌及抗酸分枝桿菌熒光染色則為病理活檢標(biāo)本診斷真菌及分枝桿菌感染提供一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟、對比更清晰的染色方法。國內(nèi)對熒光染色技術(shù)的應(yīng)用及研究大多集中在體液標(biāo)本及表面淺部如皮屑標(biāo)本中，在病理組織標(biāo)本中的研究比較少見，同時國內(nèi)現(xiàn)有的熒光染色片也存在著保存時間短的問題[4-6]。本研究采用適用于包括體液、皮屑、組織標(biāo)本等臨床各類樣本的新型熒光染色技術(shù)，對艾滋病患者石蠟包埋的活檢組織中真菌及分枝桿菌進行染色，并與目前常用的組織學(xué)六胺銀、PAS染色及萋尼抗酸染色進行對比，從而評價快速真菌熒光染色及抗酸分枝桿菌熒光染色法對艾滋病患者活檢標(biāo)本病原體診斷中的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2016年1月至2018年12月臨床確診為艾滋病患者的不同部位的病理活檢標(biāo)本500例，其中300例臨床疑似真菌感染，200例臨床疑似結(jié)核分枝桿菌感染。

1.2 試劑 六胺銀、PAS、抗酸染色試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，快速真菌熒光染色及抗酸分枝桿菌熒光染色試劑盒購自江蘇供贏聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織活檢 由臨床醫(yī)生進行相應(yīng)的檢查，對病變部位取活檢。

1.3.2 病理學(xué)檢查 取病理活檢組織，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、HE染色，由2位高年資病理醫(yī)師閱片。

1.3.3 病原學(xué)檢查 采用特殊染色(六胺銀、PAS、萋尼抗酸染色)及熒光染色(快速真菌熒光染色、抗酸分枝桿菌熒光染色)進行病原學(xué)檢查，由兩位高年資病理醫(yī)師閱片。

1.3.3.1 六胺銀染色 切片脫蠟至水，8%鉻酸水溶液20 min，水洗，5%偏重亞硫酸鈉液1 min，流水沖洗5 min，蒸餾水洗2次，切片放入六胺銀工作液并置于溫箱內(nèi)(58～60℃)60～90 min，至切片呈黃褐色為止，蒸餾水洗。滴入0.1%氯化金溶液2～3 min，流水稍洗。2%硫代硫酸鈉液2～5 min，流水沖洗5 min，伊紅復(fù)染1～2 s，水洗，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，鏡檢。

1.3.3.2 PAS染色 切片脫蠟至水，蒸餾水洗1～2 min，高碘酸溶液10 min，蒸餾水洗，甩干水分，雪夫試劑10～15 min，流水沖洗，甩干水分，蘇木素染液2～5 min，水洗，甩干水分，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，鏡檢。

1.3.3.3 萋尼抗酸染色 切片脫蠟至水，滴加石炭酸復(fù)紅染液30 min，水洗，瀝干水分，滴加酸性酒精溶液脫色1～2 min，水洗(如標(biāo)本面還可看到紅色殘余，則再滴加酸性酒精溶液至看不到紅色為止，然后繼續(xù)水洗，此操作可重復(fù)多次)，加亞甲藍(lán)溶液20～30 s，水洗，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，鏡檢。

1.3.3.4 快速真菌熒光染色 切片脫蠟至水，甩干水分，滴1滴染色液30 s，蓋上蓋玻片，以覆蓋整個樣本為準(zhǔn)，吸去多余染液，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3.5 抗酸分枝桿菌熒光染色 切片脫蠟至水，甩干水分，滴1滴染色液15 min，水洗，滴加脫色液1 min，水洗，復(fù)染1 s，水洗，甩干水分，中性樹膠封固，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 臨床診斷價值比較 采用熒光染料對石蠟包埋活檢組織中的真菌(300例可疑真菌感染的活檢標(biāo)本)及分枝桿菌(200例可疑結(jié)核的活檢標(biāo)本)進行染色，并與目前常用的真菌染色(六胺銀染色、PAS染色)及分枝桿菌染色(萋尼抗酸染色)進行對比，評價快速真菌熒光染色及抗酸分枝桿菌熒光染色法對艾滋病患者病原體診斷中的臨床診斷價值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 真菌染色

2.1.1 特殊染色 六胺銀染色見真菌呈黑褐色，PAS染色真菌呈紫紅色，可見不同形態(tài)特征的真菌孢子及菌絲，見圖1。六胺銀染色見肺孢子菌呈棕黑色圓形、卵圓形或新月形、括號形，PAS染色不著色；馬爾尼菲藍(lán)狀菌呈小圓形、卵圓形或兩端鈍圓粗細(xì)均勻的臘腸狀，有時可見橫隔；六胺銀染色見隱球菌為黑色類圓形具有厚壁莢膜的菌體，偶呈煤球樣，PAS染色見紫紅色雙折光的具有厚壁莢膜的類圓形菌體；六胺銀及PAS染色見白色假絲酵母菌的出芽孢子、藕節(jié)樣假菌絲、珊瑚樣真菌絲。曲霉菌常形成大小不等的菌絲群，菌絲較細(xì)，粗細(xì)較一致，并有銳角分支，可見分隔；毛霉菌菌絲較粗，粗細(xì)不均勻，分支少呈鈍角或直角，無分隔。六胺銀染色法檢出陽性209例，陽性率69.7%；PAS染色法檢出陽性97例，陽性率39.5%。

2.1.2 快速真菌熒光染色 真菌熒光染色在紫外激發(fā)光(UV濾鏡)下，所選300例活檢標(biāo)本中有205例可檢測到熒光染色真菌，陽性率68.3%，高于PAS染色檢出率(39.5%)，與六胺銀染色陽性率(69.7%)無顯著差異(但其中肺孢子菌陽性率低于六胺銀，馬爾尼菲藍(lán)狀菌陽性率高于六胺銀)，見表1。鏡下真菌菌絲及孢子均呈亮藍(lán)色，有較強的通透感，外表平滑、圓潤，背景黑暗，真菌的形態(tài)特征十分清晰、明顯，非常容易辨識，見圖1。

表1 常規(guī)特殊染色法與快速真菌熒光染色法的結(jié)果比較 例

注：A：真菌熒光染色見較多亮藍(lán)色圓形、卵圓形肺孢子菌，有些可見成對的囊內(nèi)小體(×400)；B：六胺銀染色見較多棕黑色圓形、卵圓形或新月形、括號形肺孢子菌(×400)；C：真菌熒光染色見較多亮藍(lán)色馬爾尼菲藍(lán)狀菌呈小圓形、卵圓形或兩端鈍圓粗細(xì)均勻的臘腸狀，有時可見橫隔；D：六胺銀染色見較多棕黑色的馬爾尼菲藍(lán)狀菌，形態(tài)同C(×400)；E：真菌熒光染色見亮藍(lán)色的具有厚壁莢膜的類圓形隱球菌菌體(×400)；F：PAS染色見紫紅色雙折光的具有厚壁莢膜的類圓形菌體(×400)；G：真菌熒光染色見亮藍(lán)色白色假絲酵母菌出芽孢子、藕節(jié)樣假菌絲、珊瑚樣真菌絲；H:PAS染色見紫紅色白色假絲酵母菌，形態(tài)同G(×400)

2.2 抗酸染色

2.2.1 萋尼抗酸染色 抗酸桿菌呈紫紅色桿狀菌體，背景藍(lán)色(圖2)。萋尼抗酸染色法檢出陽性117例，陽性率58.5%(表2)。

注：A：抗酸染色見個別紅染的桿狀分枝桿菌(×400)；B：抗酸熒光染色顯示較多金色或橙紅色熒光的桿狀分枝桿菌(×400)；C：抗酸染色見較多紅染的桿狀分枝桿菌(×400)；D：抗酸熒光染色顯示大量金色或橙紅色熒光的桿狀分枝桿菌(×400)

表2 萋尼抗酸染色法與熒光抗酸染色法的結(jié)果比較 例

2.2.2 抗酸分枝桿菌熒光染色 抗酸桿菌呈明亮的金色或橘紅色熒光的桿狀菌體，背景黑色，形狀為短桿狀、長桿狀和各種交叉桿結(jié)構(gòu)，菌體略微彎曲，形態(tài)較傳統(tǒng)的抗酸染色形態(tài)中的菌體略大，偶見亮點(菌體橫截面)或亮塊(菌體富集形成菌團)(圖2)?？顾岱种U菌熒光染色法陽性率為89.5%，萋尼抗酸染色法陽性率58.5%。顯然抗酸熒光染色法對結(jié)核桿菌的檢出率較抗酸染色法顯著升高(P<0.01)，見表2。

3 討論

我國艾滋病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，而艾滋病患者由于免疫功能低下，并發(fā)機會性感染的病原體種類多樣。研究表明，分枝桿菌感染和真菌感染是艾滋病患者機會性感染的主要類型。普通的特殊染色陽性率不高并且費時費力[7]，而快速真菌及抗酸熒光染色為活檢診斷真菌及抗酸分枝桿菌感染提供了快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟、對比更清晰的染色方法。

本研究顯示快速真菌熒光染色法在300例活檢標(biāo)本中有205例檢測到熒光染色真菌，陽性率68.3%，高于PAS染色，與六胺銀結(jié)果大致相符(但其中肺孢子菌陽性率低于六胺銀，馬爾尼菲藍(lán)狀菌陽性率高于六胺銀)，鏡下菌絲及孢子均呈亮藍(lán)色，背景黑暗，真菌的形態(tài)特征十分清晰、明顯、不易漏檢，并且操作簡便快速。

近年來，條件致病真菌引起的深部真菌病往往被誤診為其他感染甚至腫瘤，從而延誤治療，而真菌在病理切片中的檢出是診斷侵襲性真菌感染的有力證據(jù)。病理活檢標(biāo)本中真菌的早期快速識別是確保藥物治療成功的關(guān)鍵，尤其是侵襲性真菌感染。臨床抗生素的濫用可使部分患者真菌培養(yǎng)陰性，但活檢標(biāo)本特殊染色(包括快速真菌熒光染色法)則不受此影響[8-9]。通過對比，發(fā)現(xiàn)普通的特殊染色(包括六胺銀及PAS染色)操作步驟繁多，用時較長，都在1～2 h，經(jīng)常出現(xiàn)組織脫落、染色時間不夠或過染，而且如果染色細(xì)節(jié)沒有掌握好，極有可能導(dǎo)致染色效果不佳甚至失敗，該情況下真菌就不易辨識，且染色時間過長，費時費力。而快速真菌熒光染色技術(shù)通過熒光標(biāo)記技術(shù)，熒光染液中的標(biāo)記有熒光素的抗體成分能與真菌細(xì)胞壁葡聚糖層和幾丁質(zhì)層中的β-糖苷鍵特異性結(jié)合，從而通過特異性結(jié)合間接地將熒光素標(biāo)記到真菌細(xì)胞壁上，再在熒光顯微鏡下觀察，通過熒光燈的照射而激發(fā)出熒光，繼而清晰地表現(xiàn)出真菌的輪廓，以快速診斷并鑒別真菌。其利用的是抗體特異性結(jié)合加形態(tài)學(xué)觀察的原理，所以保證了真菌檢測結(jié)果的高陽性率和高準(zhǔn)確率[10]。與普通的特殊染色相對比，熒光染色只需一步(1滴成像)，用時30 s，簡單迅速；染出的真菌形態(tài)確切，真菌與背景之間的色差明顯，易于辨識。因此快速真菌熒光染色省時省力，大大縮短了真菌檢測結(jié)果的報告時間及降低了操作人員的工作強度。同時國內(nèi)對熒光染色技術(shù)的應(yīng)用及研究大多集中在體液標(biāo)本及表面淺部皮屑標(biāo)本中，而本研究中的快速真菌熒光染色技術(shù)適用于包括組織活檢標(biāo)本的多種樣本，是一種適用于臨床各種樣本的新型真菌檢測方法，可用于快速定性檢測人體組織或樣本中可能存在的各類真菌，指導(dǎo)臨床診療。

臨床對結(jié)核病的診斷多數(shù)依靠患者的臨床癥狀、X線檢查、痰涂片、細(xì)菌培養(yǎng)以及病理活檢標(biāo)本等傳統(tǒng)診斷方法[11]。而采用特殊染色直接發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌比影像學(xué)、免疫學(xué)等檢查具有更高的特異性。體液涂片及組織切片萋尼抗酸染色法是檢測結(jié)核桿菌的常用方法[12-13]。在長期實踐過程中，發(fā)現(xiàn)該檢測方法的敏感性相對較低，特異性差，且費時費力，而在鏡檢時也需要耗費大量的時間來辨認(rèn)，很容易出現(xiàn)誤診或漏診現(xiàn)象，特別是菌量較少的時候，從而延誤臨床診斷及治療。近期有研究指出[6，14]，金胺“O”熒光染色法在結(jié)核桿菌的檢驗中的臨床效果比較理想，但是缺點是無法長期保存。同時國內(nèi)對抗酸熒光染色技術(shù)的應(yīng)用及研究也大多集中在體液標(biāo)本上，而本研究采用的抗酸熒光染色技術(shù)適用于包括活檢標(biāo)本在內(nèi)的多種樣本。本研究表明在300例活檢標(biāo)本中熒光染色法分枝桿菌陽性率為89.5%，萋尼染色法為58.5%，熒光染色法檢出率比萋尼染色法高31%，當(dāng)樣本上結(jié)核桿菌很少的情況，熒光法依然可以輕松地看到。同時本研究中的抗酸熒光法技術(shù)上有所改進，與金胺“O”熒光染色法相比，此種方法染出的熒光片可以長期保存，時效性更長，更便于臨床應(yīng)用。

抗酸分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量脂質(zhì)包圍在肽聚糖的外面，所以抗酸分枝桿菌一般不易著色；抗酸分枝桿菌熒光染色試劑，它利用了抗酸分枝桿菌的嗜酸性和對熒光染料的親和性的雙重特性，使得抗酸分枝桿菌的菌壁更易被熒光染料著色。即使某些長期服用藥物的患者結(jié)核桿菌的抗酸性被破壞，但熒光染料的親和性仍保留，使得萋尼抗酸染色為陰性，而在熒光抗酸染色中呈陽性[15-16]。

抗酸分枝桿菌熒光染色提高了閱片的效率和準(zhǔn)確率，提高了臨床疑似結(jié)核感染患者的陽性檢出率，且成分中不含苯酚，安全環(huán)保，不會影響操作人員的身體健康。而萋尼染色法操作過程復(fù)雜，經(jīng)常出現(xiàn)脫色困難或染色過淺，且鏡檢較慢，人為因素對切片染色的質(zhì)量和檢出率影響較大。

可見，抗酸分枝桿菌熒光技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率高于萋尼抗酸染色法，尤其是在檢測排菌量少的患者中；同時本研究中的熒光染色法是一種檢查靈敏度高、較為方便快捷的方法，可適用于臨床各類樣本，可在結(jié)核患者的早期診斷治療中予以推廣和應(yīng)用[17-18]。

綜上所述，目前各醫(yī)院針對真菌及結(jié)核分枝桿菌的染色仍大多沿用六胺銀、PAS及萋尼抗酸染色，而本研究中快速真菌與抗酸分枝桿菌熒光技術(shù)應(yīng)用于真菌及結(jié)核分枝桿菌的臨床檢測中具有重要的意義，為活檢標(biāo)本診斷真菌及抗酸分枝桿菌感染提供一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟、對比更清晰的染色方法，可廣泛應(yīng)用于病理活檢組織石蠟切片及各類體液標(biāo)本的真菌及抗酸桿菌的常規(guī)檢出及診斷，滿足臨床需要，能夠為患者特別是艾滋病患者早期診斷提供可靠的指導(dǎo)依據(jù)。