復(fù)方黃芪顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

★ 張玉愛 張禮芳 李昕穎,2 郭智強(qiáng) 廖太祥（.南昌市博澤康醫(yī)藥科技有限公司 南昌330029；2.南昌大學(xué) 南昌 330029）

復(fù)方黃芪顆粒的處方由防風(fēng)、金銀花、首烏藤、黃芩、黃芪、薏苡仁等16 味中藥材組成，其主要功效為益氣滲濕，清熱涼血，用于治療風(fēng)濕熱相搏，客于肌膚之濕疹、玫瑰糠疹、藥物性皮炎、接觸性皮炎、多形紅斑、結(jié)節(jié)性紅斑等病癥。原中藥處方?jīng)]有固定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，很難對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行控制，為了有效在臨床中安全的應(yīng)用和推廣，因此有必要進(jìn)行相關(guān)的醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

本文對(duì)該顆粒進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，通過TLC法對(duì)處方中的首烏藤、黃芪和黃芩進(jìn)行定性鑒別，并以黃芩苷為定量指標(biāo)，用HPLC 法測定該成分的方法并進(jìn)行方法學(xué)考察，最終建立了復(fù)方黃芪顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床用藥的安全、有效和穩(wěn)定。

1 儀器與材料

1.1 儀器KQ2200DB 型超聲波清洗機(jī)（昆山超聲波儀器有限公司）；ZF-2 型紫外儀（上海安亭電子儀器廠）；BS25S 型電子天平（德國賽多利斯儀器有限公司，d=0.01 mg）；LC-10AT 型高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；硅膠G 板（青島海洋化工廠）。

1.2 材料大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-200110），黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201717），黃芩苷對(duì)照品（110715-200815），以上均購自中國藥品生物制品檢定研究院。首烏藤是蓼科植物何首烏的干燥藤莖；黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根；黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。復(fù)方黃芪顆粒供試品三批（170508、170511、170514）及陰性樣品均由本公司自制。甲醇為色譜純；水為超純水（自制）；其它化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 首烏藤的薄層色譜鑒別首烏藤中的主要化學(xué)成分為大黃素［1］。①供試品溶液的配制：取本品20 g，研細(xì)，加硅藻土5 g，研勻，加鹽酸和水各5 mL，攪勻，再加乙酸乙酯50 mL，振搖15 min，超聲處理45 min，取出，濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。②對(duì)照品溶液的配制：另取大黃素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。③陰性溶液的配制：取缺首烏藤藥材的復(fù)方黃芪顆粒內(nèi)容物20 g，按供試品溶液制備的方法制成首烏藤陰性對(duì)照品溶液。④薄層色譜鑒別條件：照2015 版《中國藥典》薄層色譜法（第四部通則0502）試驗(yàn)［2］，使用定量點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－甲酸（60∶20∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于日光燈下檢視。⑤結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照溶液色譜無上述斑點(diǎn)檢出。說明本法專屬性強(qiáng)，可以作為首烏藤的鑒別。

圖1 首烏藤薄層鑒別圖譜

2.1.2 黃芪中黃芪甲苷的薄層色譜鑒別黃芪中的主要化學(xué)成分為黃芪甲苷［3］。①供試品溶液的配制：取本品10 g，研細(xì)，加甲醇40 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液加在中性氧化鋁柱（100～120 目，10 g，內(nèi)徑為10-15 mm）上，用40 %甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用水飽和正丁醇萃取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用20 mL 水洗滌2 次，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。②對(duì)照品溶液的配制：另取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。③黃芪陰性對(duì)照溶液的配制：再取缺黃芪藥材的復(fù)方黃芪顆粒內(nèi)容物10g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對(duì)照品溶液。④檢查方法：照2015 版《中國藥典》薄層色譜法（第四部通則0502）試驗(yàn)［2］，使用定量點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取上述對(duì)照品溶液2 μL，供試品溶液10 μL，陰性對(duì)照品溶液10 μL 分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。⑤結(jié)果：在紫外365 nm 下檢視，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照溶液色譜中，無上述斑點(diǎn)檢出。說明本法專屬性強(qiáng)，可以作為黃芪的鑒別。

圖2 黃芪薄層鑒別圖譜

2.1.3 黃芩中黃芩苷的薄層色譜鑒別黃芩中的主要化學(xué)成分為黃芩苷［4］。①供試品溶液的配制：取本品10 g，研細(xì)，加5 %甲酸甲醇溶液30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用20 mL 乙酸乙酯萃取2 次，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。②對(duì)照品溶液的配制：另取黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。③黃芩陰性對(duì)照溶液的配制：再取缺黃芩藥材的復(fù)方黃芪顆粒內(nèi)容物10 g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對(duì)照品溶液。④檢查方法：照2015 版《中國藥典》薄層色譜法（第四部通則0502）試驗(yàn)［2］，使用定量點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取上述供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液5 μL，陰性對(duì)照品溶液10 μL 分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液。⑤結(jié)果：供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照品溶液色譜中，無上述斑點(diǎn)檢出。說明本法專屬性強(qiáng)，可以作為黃芩的鑒別。

圖3 黃芩薄層鑒別圖譜

2.2 黃芩苷的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［2］色譜條件：島津高效液相色譜儀；PolyPak TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.2 %磷酸溶液（47∶53）；柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，進(jìn)樣量為10 μL。在此色譜條件下，供試品中的黃芩苷與其他成分有較好的分離度，陰性樣品對(duì)指標(biāo)成分含量測定無干擾。

圖4 高效液相色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取適量的黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含黃芩苷約40 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備取本品適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70 %乙醇溶液20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70 %乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例，稱取缺少黃芩的復(fù)方黃芪顆粒的藥材，按照制備工藝配制，然后依照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察精密稱取黃芩苷對(duì)照品45 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.9 mg/mL 的對(duì)照品貯備液。再分別精密吸取對(duì)照品貯備液0.5、1、2、3、4、5、10 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。吸取上述溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按以上色譜條件測定，記錄色譜圖，以測定濃度X（mg/mL）對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=4×106X-6 476.5，r=0.9999（n=7），試驗(yàn)結(jié)果表明黃芩苷在0.045 69 mg/mL～0.913 9 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn)精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL,按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果對(duì)照品溶液峰面積RSD=0.31%（n=6），表明該儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)分別精密稱取同一批樣品約1 g（批號(hào)170508）6 份，按照供試品溶液制備方法制備，依法測定樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果6 份黃芩苷的含量分別為1.303，1.320，1.327，1.311，1.315，1.319 mg/g，平均含量為1.316 mg/g，RSD為0.62%（n=6），表明該方法在同一條件下重復(fù)性好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物（批號(hào)：170508）約1.0g，精密稱定，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，室溫放置，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 分別吸取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果峰面積的RSD 為0.25%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率取同一批次項(xiàng)下的顆粒，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入黃芩苷對(duì)照品溶液（0.507 1 mg/mL）1 mL，按含量測定方法項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液進(jìn)行測定，平行6 份，計(jì)算回收率。

表1 黃芩苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 樣品含量測定分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算3 批中試樣品含量，三批中試樣品（170508、170511、170514）含量分別為1.331 mg/g、1.352 mg/g、1.313 mg/g。

3 討論

3.1 專屬性考察本試驗(yàn)對(duì)處方中的金銀花、黃連、首烏藤、黃芪和黃芩等進(jìn)行了薄層鑒別條件摸索，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，金銀花、黃連等均有陰性干擾，首烏藤、黃芪和黃芩供試品色譜與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的顏色斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾。因此確定了首烏藤、黃芪和黃芩作為薄層鑒別方法，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠。

3.2 檢測波長的選擇采用二極管陣列檢測器對(duì)黃芩苷對(duì)照品色譜峰進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果黃芩苷在280 nm 波長處有最大吸收，由于280 nm 雜峰對(duì)目標(biāo)峰干擾少且穩(wěn)定，故選擇280 nm 作為檢測波長。

3.3 提取方法的選擇對(duì)加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行了摸索及確定，進(jìn)行了三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，提取次數(shù)對(duì)提取工藝影響最大，其次是加水量，提取時(shí)間對(duì)提取工藝影響較小。從經(jīng)濟(jì)成本、實(shí)際生產(chǎn)考慮，確定本品提取最佳工藝條件為：加水量為8 倍，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為2 次。

3.4 制劑工藝的選擇日常生產(chǎn)過程中，中藥顆粒劑一般采用蔗糖作為矯味劑，糊精、淀粉作為粘合劑，我們分別對(duì)其進(jìn)行了考察，并以溶化性作為參考依據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖加糊精，溶化完全，無分層現(xiàn)象；蔗糖加淀粉，溶化性不好，出現(xiàn)少量分層現(xiàn)象。故根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用蔗糖、糊精作為制劑成型輔料。

3.5 色譜條件的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)通過摸索乙腈與0.2 %磷酸水溶液、甲醇與0.2 %磷酸水溶液以及甲酸與0.2 %磷酸水溶液按一定比例混合作為流動(dòng)相，考察其分離度，結(jié)果以甲醇-0.2 %磷酸溶液（47∶55）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃、PolyPak TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）的色譜條件下供試品中黃芩苷與其他共存組分峰能達(dá)到良好的分離。

本實(shí)驗(yàn)建立了復(fù)方黃芪顆粒中黃芩苷的HPLC含量測定方法。結(jié)果表明，所建立的方法操作簡便、結(jié)果可靠、重復(fù)性好。