馬鈴薯薯渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料的工藝研究

懷寶東， 閆鳳超*， 李佩然， 趙曉鋒， 李蘭紅， 孫興榮，李佩珊

（1.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150038；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163316；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150038）

馬鈴薯薯渣作為淀粉制品加工環(huán)節(jié)的主要廢棄物，因其水分含量高、體積大、雜菌數(shù)量多、不便儲(chǔ)運(yùn)等原因造成再利用率低和環(huán)境污染嚴(yán)重等突出問題，直接影響著我國(guó)淀粉制品工業(yè)的良性循環(huán)和生態(tài)環(huán)境安全 （王文俠，2005年；Mayer，1998）。合理利用馬鈴薯薯渣再生產(chǎn)和提高二次加工的經(jīng)濟(jì)效益成為近年來的研究熱點(diǎn)，目前二次加工應(yīng)用技術(shù)主要包括薯渣制作有機(jī)肥，可食性包裝膜，食用菌袋栽物料，發(fā)酵生產(chǎn)高品質(zhì)飼料、酒精和提取果膠等技術(shù)。多數(shù)技術(shù)受到加工工藝、市場(chǎng)需求、經(jīng)濟(jì)效益等因素限制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化利用速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于產(chǎn)生速率，而具有規(guī)模加工、經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和實(shí)際可操作性的再加工工藝仍鮮有報(bào)道（曾凡逵，2014；卞雪，2012；盧嘉寶，2011；廖原，2011）。隨著我國(guó)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略性發(fā)展，過量的馬鈴薯薯渣生產(chǎn)發(fā)酵菌體蛋白飼料模式在畜牧業(yè)領(lǐng)域的探索應(yīng)用將會(huì)更加廣泛深入 （蔡輝益，2018）。

馬鈴薯薯渣菌體蛋白飼料能增加蛋白質(zhì)含量，提高機(jī)體免疫力，調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，降低飼養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益 （段永蘭，2010；Avery，2005）。目前馬鈴薯薯渣微生物發(fā)酵飼料方式主要包括固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種，固態(tài)發(fā)酵技術(shù)因其高產(chǎn)、簡(jiǎn)易、低投資和低能耗等優(yōu)點(diǎn)，便于工廠化加工和農(nóng)戶小規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)用范圍廣泛 （陳洪章，2004）。張?chǎng)蔚龋?002）采用復(fù)合微生物菌株對(duì)馬鈴薯薯渣進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)和真蛋白含量達(dá)到35.63%和14.05%；馬振貴等（2011）研究最佳固態(tài)發(fā)酵工藝為含水量63%、尿素3.6%、假絲酵母接種時(shí)間3.67 h，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量為20.8%，比初始薯渣提高69.3倍；劉雪蓮等（2009）以黑曲霉、白地霉和熱帶假絲酵母為發(fā)酵菌種，工藝優(yōu)化后的發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量為43.9%；張立宏等（2015）優(yōu)化馬鈴薯薯渣液體培養(yǎng)工藝，蛋白質(zhì)含量達(dá)到9.0 g/L。因此優(yōu)化微生物發(fā)酵工藝生產(chǎn)高蛋白和高品質(zhì)飼料具有重要的意義。本研究以馬鈴薯薯渣為主要原料，以黑曲霉、熱帶假絲酵母、解脂假絲酵母、啤酒酵母為協(xié)作發(fā)酵菌株，優(yōu)化馬鈴薯薯渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料的工藝條件，為提高馬鈴薯薯渣飼料的綜合利用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 黑曲霉 （Aspergillus niger，CICC 2041）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis，CICC 32019）、 解脂假絲酵母 （Candida lipolytica，CICC 32696）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，CICC 1921）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；馬鈴薯薯渣 （粗蛋白質(zhì)和真蛋白干基含量分別為6.7%和5.1%）：七臺(tái)河市馬鈴薯淀粉制品有限公司；小麥麩皮：市售；葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸銨：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母抽提物、瓊脂、胰蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 ～ 20 g，蒸餾水 1000 mL，pH 自然；LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4；馬鈴薯薯渣固態(tài)物料培養(yǎng)基：薯渣85%，麩皮15%，（NH4）2SO42.0%，KH2PO41.0%，MgSO4·7H2O 0.5%，物料水分至65%～70%，pH自然，其中（NH4）2SO4、KH2PO4和 MgSO4·7H2O 添加比例按照馬鈴薯薯渣和麩皮總量計(jì)算。

1.2 儀器與設(shè)備 LE104E電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；BCD-312WDPM 4℃冷藏冰箱：海爾集團(tuán)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；K9840凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；HWS-250恒溫培養(yǎng)箱：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；LDZH-200L高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HY-4振蕩培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；RHP-600型粉碎機(jī)：上海榮浩食品機(jī)械有限公司；KND-20C消煮爐：上海力辰儀器科技有限公司；GZX恒溫干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與培養(yǎng) 黑曲霉菌種：將黑曲霉原種接種于PDA培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)72 h，在40～50℃低溫烘干制作成物料菌種待用（江成英，2015）。

酵母菌株：分別將酵母菌原種接種于LB固體培養(yǎng)基，在32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用接菌環(huán)挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單一酵母菌株接種到LB固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，48 h后轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用顯微鏡鏡檢孢子方式快速直接觀察菌體數(shù)量，待菌體孢子數(shù)量超過1×108cfu/mL時(shí)冷藏備用。

1.3.2 菌體蛋白飼料發(fā)酵工藝流程 將馬鈴薯薯渣固態(tài)物料培養(yǎng)基充分混勻，調(diào)節(jié)水分至65%～70%，分別稱取物料150 g于250 mL三角瓶中，蓋好透氣性膠塞，100℃常壓滅菌30 min，每個(gè)處理4次重復(fù)，冷卻后于無菌間接種含黑曲霉和酵母菌的馬鈴薯薯渣固態(tài)物料二級(jí)菌種質(zhì)量1%，混勻后于32℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，前24 h好氧發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)每隔8 h翻動(dòng)攪拌一次，物料層顆粒均勻長(zhǎng)滿黑曲霉菌株的白色菌體，在未長(zhǎng)出黑色孢子時(shí)進(jìn)行后48 h厭氧發(fā)酵培養(yǎng)，將物料裝入50 kg塑料包裝袋中密閉培養(yǎng)，物料發(fā)酵完成后產(chǎn)生濃郁的酒香氣味，將物料烘干粉碎，對(duì)發(fā)酵成品進(jìn)行成分測(cè)定，發(fā)酵物料可直接供動(dòng)物食用或烘干后食用。

1.3.3 發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)研究 分別考察復(fù)合微生物組合（黑曲霉、解脂假絲酵母、釀酒酵母、熱帶假絲酵母、黑曲霉+解脂假絲酵母、黑曲霉+釀酒酵母、黑曲霉+熱帶假絲酵母、黑曲霉+解脂假絲酵母+釀酒酵母、黑曲霉+解脂假絲酵母+熱帶假絲酵母、黑曲霉+釀酒酵母+熱帶假絲酵母和黑曲霉+解脂假絲酵母+釀酒酵母+熱帶假絲酵母），薯渣：麩皮（m/m）分別為 100：0、95：5、90：10、85：15、80：20，硫酸銨添加量 （1%、2%、3%、4%、5%）， 接菌量 （1%、3%、5%、7%、9%）， 培養(yǎng)溫度（28、30、32、34、36 ℃），培養(yǎng)時(shí)間（48、60、72、84、96 h）對(duì)馬鈴薯薯渣菌體蛋白飼料中真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響，確定單因素試驗(yàn)最佳水平。

1.3.4 固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以物料質(zhì)量配比（A）、硫酸銨添加量（B）、培養(yǎng)溫度（C）和培養(yǎng)時(shí)間（D）為考察對(duì)象，以真蛋白增長(zhǎng)率為指標(biāo)（Y），確定優(yōu)化馬鈴薯薯渣固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白的最佳工藝條件，設(shè)計(jì)4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)的因素與水平見表1。針對(duì)馬鈴薯薯渣固態(tài)發(fā)酵最佳工藝參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵原料為200 kg的中試驗(yàn)證試驗(yàn)，中試地點(diǎn)布置于黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院佳木斯院區(qū)微生物發(fā)酵中試車間。利用木質(zhì)板制作的發(fā)酵盒（50 cm×50 cm）裝填物料高度6～8 cm，發(fā)酵車間滅菌后將菌種與發(fā)酵盒內(nèi)物料充分混勻蓋上無菌紗布保濕，工藝參數(shù)與最佳工藝參數(shù)保持一致，驗(yàn)證工藝參數(shù)規(guī)?；a(chǎn)的穩(wěn)定性及可靠性。

表1 馬鈴薯渣發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料的正交試驗(yàn)因素與水平L9（43）

1.4 測(cè)定方法 粗蛋白質(zhì)：按照GB/T 5009.5-2010食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法進(jìn)行（全國(guó)文獻(xiàn)工作標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)，2010）；真蛋白：參考王興華（2008）方法進(jìn)行測(cè)定；可溶性糖：參考沈飛（2010）的方法進(jìn)行測(cè)定；水分：按照GB/T 5009.3-2016食品中水分的測(cè)定方法進(jìn)行 （全國(guó)文獻(xiàn)工作標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)，2016）；真蛋白增長(zhǎng)率/%=（發(fā)酵后真蛋白含量-發(fā)酵前真蛋白含量）/發(fā)酵前真蛋白含量（干基）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種組合對(duì)固態(tài)發(fā)酵工藝的影響 試驗(yàn)固定物料質(zhì)量比（薯渣∶麩皮）為 85∶15、硫酸銨添加量2%、培養(yǎng)溫度32℃、接菌量均為1%，研究不同菌株組合對(duì)粗蛋白質(zhì)和真蛋白的影響 （表2），不同菌株組合對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)、真蛋白和可溶性糖含量影響較大，黑曲霉+解脂假絲酵母+釀酒酵母+熱帶假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)和真蛋白含量值最高，分別為20.13%和18.02%，是由于黑曲霉作為糖化功能菌株為酵母菌的生存環(huán)境提供可溶性糖，從而達(dá)到互利共生的作用。

表2 復(fù)合菌種組合對(duì)固態(tài)發(fā)酵工藝的影響%

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 物料質(zhì)量比對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響固定硫酸銨添加量2%、培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)時(shí)間72 h、黑曲霉+熱帶假絲酵母+解脂假絲酵母+啤酒酵母接菌量均為1%，研究馬鈴薯薯渣與麩皮不同物料質(zhì)量比對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖1。

隨著馬鈴薯薯渣添加比例的逐漸減小和麩皮添加比例的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)與真蛋白指標(biāo)含量逐漸增大，但利用微生物將物料中無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白的數(shù)量減小，當(dāng)馬鈴薯薯渣物料質(zhì)量比例（薯渣∶麩皮）低于85∶15時(shí)，真蛋白含量增加幅度減小，經(jīng)計(jì)算得出真蛋白增長(zhǎng)率先增大后減小，在物料質(zhì)量比（薯渣∶麩皮）為85∶15時(shí)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)最高，因此選擇馬鈴薯薯渣物料質(zhì)量比例（薯渣∶麩皮）為 85∶15。

圖1 馬鈴薯渣和麩皮添加比例對(duì)工藝的影響

2.2.2 硫酸銨添加量對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響固定物料質(zhì)量比（薯渣∶麩皮）為 85∶15、培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)時(shí)間72 h、黑曲霉+熱帶假絲酵母+解脂假絲酵母+啤酒假絲酵母接菌量均為1%，研究硫酸銨不同添加量對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 硫酸銨添加量對(duì)工藝的影響

隨著硫酸銨添加量的逐漸增大，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)指標(biāo)含量逐漸增大，真蛋白含量先增加后減小，當(dāng)硫酸銨含量高于2%時(shí)，過量的無機(jī)氮源抑制微生物菌體的生長(zhǎng)發(fā)育，呼吸作用減小造成無機(jī)氮轉(zhuǎn)化菌體蛋白的能力受到抑制；當(dāng)硫酸銨含量為2%時(shí)，真蛋白含量指標(biāo)為最高值（18.37±0.15）%。

2.2.3 接菌量對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響 固定物料質(zhì)量比（薯渣∶麩皮）為85：15、硫酸銨添加量2%、培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)時(shí)間72 h、黑曲霉+熱帶假絲酵母+解脂假絲酵母+啤酒假絲酵母接菌量均為1%，研究不同接菌量對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 接菌量對(duì)工藝的影響

隨著接菌量的逐漸增加，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)和真蛋白指標(biāo)含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，表明適量的增加接菌量能夠提高發(fā)酵產(chǎn)物中的真蛋白含量，但多菌種之間的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致黑曲霉糖化作用產(chǎn)生的可溶性糖含量急劇下降，影響微生物生長(zhǎng)發(fā)育，結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益選擇接菌量為1%。

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響 固定物料質(zhì)量比（薯渣∶麩皮）為 85∶15、硫酸銨添加量2%、發(fā)酵時(shí)間72 h、黑曲霉+熱帶假絲酵母+解脂假絲酵母+啤酒假絲酵母接菌量均為1%，研究不同發(fā)酵溫度對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)工藝的影響

隨著發(fā)酵溫度的逐漸增加，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)和真蛋白指標(biāo)含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，溫度32℃時(shí)微生物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生的真蛋白含量最高，為固態(tài)發(fā)酵的最佳溫度。

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響 固定物料質(zhì)量比（薯渣∶麩皮）為 85∶15、硫酸銨添加量2%、培養(yǎng)溫度32℃、黑曲霉+熱帶假絲酵母+解脂假絲酵母+啤酒假絲酵母接菌量均為1%，研究不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)工藝的影響

隨著發(fā)酵時(shí)間的逐漸增加，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)和真蛋白指標(biāo)含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，發(fā)酵前期好氧狀態(tài)下黑曲霉菌種糖化作用促進(jìn)菌體蛋白的繁殖生長(zhǎng)，利于真蛋白含量的增加；發(fā)酵后期厭氧狀態(tài)下糖化作用產(chǎn)生的發(fā)酵時(shí)間72 h真蛋白含量最高。

由圖5可知，每隔12 h取樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)酵樣品粗蛋白質(zhì)含量及增長(zhǎng)率隨時(shí)間的變化逐漸增大，在樣品培養(yǎng)72 h之后，蛋白質(zhì)含量變化不大；可溶性糖含量在加入酵母菌后的12 h，物料當(dāng)中的可溶性糖迅速下降，還原糖被菌體迅速利用，而在12～36 h時(shí)由于黑曲霉的糖化作用明顯，可溶性糖含量保持在8%以上，為避免黑曲霉產(chǎn)生孢子，將物料進(jìn)行密閉培養(yǎng)，由于培養(yǎng)環(huán)境的改變，導(dǎo)致可溶性糖含量逐漸降低，而在84～96 h時(shí)，還原糖含量下降速度較低，一方面酵母菌開始老化，另一方面培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分降低，因此菌體利用還原糖的速率降低；在72 h之后可溶性糖含量較小且變化不大，此時(shí)說明菌體利用糖的速度與菌體自溶釋放糖的速度基本相同，因此糖的含量變化很小。因此可以看出最佳培養(yǎng)時(shí)間是72 h。

2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析 由表3可知，4個(gè)因素對(duì)有機(jī)氮增長(zhǎng)率影響的主次順序?yàn)锽＞A＞C＞D，其中，硫酸銨添加量對(duì)馬鈴薯薯渣發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料中真蛋白含量提高的影響最為顯著，其次為薯渣與麩皮的質(zhì)量比例組合與培養(yǎng)溫度，影響最小的因素為培養(yǎng)時(shí)間。最適宜固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料的工藝組合為A2B2C2D1。即薯渣與麩皮的質(zhì)量例為85S+15F，硫酸銨添加量為2%，培養(yǎng)溫度32℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h。通過正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果表明（表4），前三個(gè)因素A、B、C對(duì)馬鈴薯薯渣發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料真蛋白增長(zhǎng)率的影響均具有顯著差異性水平（P＜0.05），因素D對(duì)真蛋白增長(zhǎng)率的影響差異不顯著，因此，選擇短時(shí)間固態(tài)發(fā)酵省時(shí)省經(jīng)濟(jì)成本且效果顯著。

表3 馬鈴薯渣發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料的工藝條件 L9（43）正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.4 菌體蛋白飼料工藝條件驗(yàn)證 根據(jù)優(yōu)化發(fā)酵工藝確定最佳條件為馬鈴薯薯渣固態(tài)物料培養(yǎng)基：薯渣∶麩皮=85∶15，硫酸銨添加量 2.0%，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，黑曲霉+熱帶假絲酵母+解脂假絲酵母+啤酒假絲酵母接菌量均為1%，進(jìn)行中試1 T發(fā)酵原料驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量20.16%，真蛋白含量18.3%，與正交工藝優(yōu)化獲取的粗蛋白質(zhì)和真蛋白含量相一致，表明馬鈴薯薯渣固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白飼料工藝單因素試驗(yàn)與正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果可靠。

3 討論

3.1 固態(tài)發(fā)酵方式對(duì)菌體蛋白飼料發(fā)酵工藝的影響 有研究報(bào)道表明，固態(tài)發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于廢渣廢料的處理，具有易干燥、高回收等特點(diǎn)，可把發(fā)酵物（包括發(fā)酵底物、菌體及其代謝產(chǎn)物）全部利用，既保留了活性成分又不會(huì)產(chǎn)生廢液污染（趙鳳敏，2006；陳洪章，2004）。本試驗(yàn)未選取液態(tài)發(fā)酵是因其發(fā)酵設(shè)備成本較高，發(fā)酵產(chǎn)物固液分離工藝繁瑣，工藝產(chǎn)生大量發(fā)酵廢水，不適宜小規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，固態(tài)發(fā)酵最佳工藝條件下發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量為20.28%，粗蛋白質(zhì)增長(zhǎng)率為59.2%；真蛋白含量18.4%，真蛋白增長(zhǎng)率為194.4%；可溶性糖含量為6.07%，通過多菌種協(xié)作固態(tài)發(fā)酵能夠顯著增加發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)和真蛋白含量，與前人研究的結(jié)論相一致（周芳，2015；楊希娟，2009）。固體發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)與真蛋白含量的提高來源于非蛋白氮源的發(fā)酵合成過程和蛋白質(zhì)的“濃縮效應(yīng)”，因非蛋白質(zhì)物質(zhì)的損耗進(jìn)而提高粗蛋白質(zhì)和真蛋白含量指標(biāo)屬于表觀現(xiàn)象，物料總蛋白質(zhì)含量并未出現(xiàn)真正的增加（羅明朗，1996）。發(fā)酵物料中的非蛋白氮源經(jīng)過酵母菌的發(fā)酵利用生成能夠被動(dòng)物直接吸收利用的真蛋白，進(jìn)而提升發(fā)酵產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性是固態(tài)發(fā)酵的核心關(guān)鍵控制點(diǎn)。

以固態(tài)發(fā)酵為前提采用前24 h好氧發(fā)酵方式和后48 h厭氧發(fā)酵方式的工藝路線，與前人單一的固態(tài)好氧發(fā)酵和液態(tài)厭氧發(fā)酵工藝不一致。主要原因是接菌物料經(jīng)過24 h的發(fā)酵培養(yǎng)與數(shù)次的翻動(dòng)混勻，物料層均勻長(zhǎng)滿黑曲霉菌株的白色菌體，并在透氣性好的發(fā)酵物料表層生長(zhǎng)出一層黑曲霉黑色孢子，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的持續(xù)，黑色孢子數(shù)量將成幾何倍數(shù)增長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物含有大量的黑曲霉孢子將造成動(dòng)物身體的傷害。因此，發(fā)酵工藝條件選擇前24 h好氧發(fā)酵，在物料中菌絲體長(zhǎng)滿但未產(chǎn)生黑色孢子時(shí)進(jìn)行厭氧發(fā)酵方式，物料中自身攜帶和黑曲霉代謝產(chǎn)物的糖化作用生成的可溶性糖含量能夠滿足酵母菌的生長(zhǎng)需求，通過發(fā)酵后產(chǎn)物中殘留大量可溶性糖含量表明好氧-厭氧工藝能夠滿足酵母菌在發(fā)酵過程中對(duì)可溶性糖的需求，合理利用好氧性黑曲霉與兼性厭氧性酵母菌各自特點(diǎn)進(jìn)行協(xié)作不僅能夠滿足工藝合理性和安全性的要求，還能提高發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量和適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

3.2 不同工藝參數(shù)對(duì)菌體蛋白飼料發(fā)酵工藝的影響 微生物生長(zhǎng)發(fā)酵需要充足的氮源以滿足正常生長(zhǎng)需要和代謝合成細(xì)胞物質(zhì)（蛋白質(zhì)、氨基酸和核核酸等）（吳萍，2008）。馬鈴薯薯渣中氮源成分含量低是未被充分利用二次加工的主要原因，在馬鈴薯薯渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麩皮和硫酸銨成分能夠彌補(bǔ)馬鈴薯薯渣氮源不足的問題，本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)麩皮添加量為15%和硫酸銨添加量為2%時(shí)，粗蛋白質(zhì)增長(zhǎng)率和真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)最高?？赡苡捎诋?dāng)麩皮含量小于15%，物料氮源含量不足影響酵母菌蛋白含量的轉(zhuǎn)化；當(dāng)麩皮含量大于15%時(shí)，酵母菌大量繁殖導(dǎo)致物料自身和黑曲霉糖化作用產(chǎn)生的可溶性糖含量急劇降低，酵母菌生長(zhǎng)受到影響導(dǎo)致粗蛋白質(zhì)含量增幅較小，這與程方（2015）和劉樹棟（2014）研究結(jié)果相一致。麩皮添加量越大，物料中的總蛋白含量越高，但過多的麩皮含量增加了成本投入，結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益成本和真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)考慮，麩皮添加量為15%。添加的硫酸銨含量能夠提高物料中粗蛋白質(zhì)含量，但過多的無機(jī)氮源能夠抑制微生物菌體的生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致其呼吸作用減小，影響粗蛋白質(zhì)、真蛋白含量及增長(zhǎng)率，因此，單因素試驗(yàn)硫酸銨最佳的添加量為2%，這與羅明朗（2016）研究非蛋白氮含量不超過3%的結(jié)果相一致。

發(fā)酵溫度是影響微生物存活和生長(zhǎng)的主要因素之一，溫度升高，微生物生長(zhǎng)繁殖速率加快；溫度過高，蛋白質(zhì)初步變性而抑制酶活性，降低微生物生長(zhǎng)繁殖速率，因此，適宜的溫度能夠促進(jìn)微生物的繁殖生長(zhǎng)（桑亞新，2017）。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵溫度32℃時(shí)粗蛋白質(zhì)與真蛋白含量最高，無機(jī)氮轉(zhuǎn)生成有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化速率最好，與劉雪蓮等（2009）研究結(jié)果一致。發(fā)酵時(shí)間是影響飼料中真蛋白含量的重要因素，發(fā)酵時(shí)間短，酵母菌未能充分利用速效碳源繁殖生長(zhǎng)，無機(jī)氮轉(zhuǎn)化真蛋白速率過低；發(fā)酵周期長(zhǎng)，生產(chǎn)成本增加。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間超過72 h的粗蛋白質(zhì)含量變化差異較小，可溶性糖含量在發(fā)酵時(shí)間48 h后迅速降低，最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

目前國(guó)內(nèi)外馬鈴薯薯渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料研究主要集中在提高粗蛋白質(zhì)含量階段（楊柳燕 ，2007；Villas-Boas，2003；Gutierrez-correa，1999），有關(guān)菌體蛋白飼料中真蛋白含量及真蛋白增長(zhǎng)量指標(biāo)的研究較少，本試驗(yàn)著重選取真蛋白含量和真蛋白增長(zhǎng)率指標(biāo)作為評(píng)判依據(jù)，取得較好的試驗(yàn)結(jié)果。在黑曲霉和酵母菌混合發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶和蛋白酶活性指標(biāo)未進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于活性物質(zhì)有待進(jìn)一步深入研究討論。

4 結(jié)論

利用復(fù)合菌株固態(tài)發(fā)酵馬鈴薯薯渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料，優(yōu)化發(fā)酵工藝確定最佳條件為馬鈴薯薯渣固態(tài)物料培養(yǎng)基：薯渣∶麩皮=85∶15，硫酸銨添加量為2.0%，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，黑曲霉+熱帶假絲酵母+解脂假絲酵母+啤酒假絲酵母接菌量均為1%；固態(tài)物料好氧發(fā)酵24 h，物料顆粒表面布滿均勻白色菌絲體；厭氧發(fā)酵48 h，產(chǎn)生濃郁的酒香氣味，此時(shí)粗蛋白質(zhì)含量與真蛋白含量分別增長(zhǎng)28.28%和18.40%。此方法投資少、效益高、工藝較簡(jiǎn)單、成本低，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用，為我國(guó)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白飼料提供了一個(gè)新的途徑。